Задать вопрос
Задать вопрос
специалисту

Статьи

Антивирусная активность рекомбинантного интерферона альфа-2b в комбинации с некоторыми антиоксидантами

Разделы [+]

Наши партнеры

Антивирусная активность рекомбинантного интерферона альфа-2b в комбинации с некоторыми антиоксидантами

[guest]

[member]
Васильев А.Н., Дерябин П.Г., Галегов Г.А.

Институт доклинической и клинической экспертизы лекарственных средств ФГБУ НЦЭСМП Минздравсоцразвития.
Научно-исследовательский институт вирусологии имени Д.И. Ивановского РАМН.

Введение

Проблема терапии наиболее распространенных и социально значимых вирусных инфекций (ОРВИ, инфекции вируса семейства герпеса) крайне актуальна в настоящий момент, поскольку именно эти инфекции относятся к самым распространенным вирусным инфекциям среди населения: местные проявления герпетической или гриппозной инфекции встречаются практически у каждого человека ежегодно [8, 9, 10]. Несмотря на обилие специфических противовирусных препаратов, проблема терапии вышеперечисленных инфекций полностью не решена, поскольку довольно часто имеет место инфицирование  вирусами  с устойчивостью к специфическим лекарственным препаратам. Так же следует отметить тот факт, что специфические противогерпетические препараты, обладая высокой активностью при купировании проявлений инфекции, не достаточно эффективны в предупреждении возникновения рецидивов [3,4].

Сложности при идентификации возбудителя, изменчивость возбудителей и формирование устойчивости вирусов к химиопрепаратам  требуют применения для терапии заболеваний универсальных противовирусных средств, обладающих активностью по отношению к широкому спектру вирусов. Такими свойствами обладает интерферон альфа-2b  человеческий рекомбинантный — аналог эндогенного интерферона альфа человека. Интерферон альфа-2b обладает противовирусными, иммуномодулирующими и антипролиферативными свойствами, а так же антимикробной активностью за счет способности стимулировать систему фагоцитов. Интерферон альфа-2b является универсальным противовирусным средством, эффективен в отношении широкого спектра вирусов.   

В настоящий момент не вызывает сомнения факт участия антиоксидантов в регуляции клеточного иммунитета. Внутриклеточный окислительно-восстановительный  баланс является регуляторным фактором в процессах Т- клеточной активации, секреции лимфокинов макрофагами, а также клеточной гибели при апоптозе.  Выявлено стимулирующее воздействие  антиоксидантов на фагоцитирующую активность макрофагов. Антиоксиданты защищают Т-клетки от гибели по апоптотическому типу под воздействием ФНО. Показано, что антиоксиданты обладают противовирусной активностью in vitro и in vivo: при использовании антиоксидантов наблюдается торможение развития вирусной инфекции [1, 2, 5].  В исследованиях  [10, 20]  показано, что  антиоксиданты способны влиять на функционирование и активность системы  ИФН в организме. В работах [2, 12, 13]  показано наличие выраженного синергидного эффекта комбинации интерферона альфа-2b и антиоксидантов in vitro и  in vivo: в присутствии антиоксидантов специфическая противовирусная активность интерферона увеличивается в несколько раз, что позволяет существенно повысить эффективность терапии и снизить возможность проявления побочных эффектов.

Целью настоящей работы явилось изучение in vitro противовирусной активности сочетаний интерферона альфа-2b с различными антиоксидантами в отношении  вируса  гриппа и вируса простого герпеса (эталонные штаммы и  клинический изолят вируса простого герпеса, выделенный от больного и обладающий резистентностью к ацикловиру).

Материалы и методы

Вирусы. Вирус гриппа А H5N1. Штамм депонирован в коллекции вирусов НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. Инфекционный титр вируса в культуре клеток MRC5 по нашим данным составил 5,5-6,0 LgТЦД50. Вирус простого герпеса ВПГ-1/Л2  тип 1, штамм Л2 и  вирус простого герпеса ВПГ-1/(F+) тип 1, штамм (F+ ). Штаммы депонированы в коллекции вирусов НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. Инфекционный титр вирусов в культуре клеток Vero по нашим данным составил  6,0-6,5 lg ТЦИД50/мл. ВПГ-1  изолят avd. Вирус выделен в 2006 году от больного  рецидивирующим ВПГ по стандартной методике [7]. По антигенной структуре, по данным МФА а, так же по наличию специфического цитопатического эффекта в культуре клеток Vero  (образование синцитиев) вирус  подобен ВПГ-1.  ИД50 для ацикловира 12,5 мкг/мл,    ЭД100 для ацикловира 25  мкг/мл. Изолят относится к ацикловирезистентным штаммам.

Культура клеток. Исследования проводили с использованием культуры клеток легкого эмбриона человека MRC5, культуры клеток почки зеленой мартышки Vero и культуры клеток почки эмбриона свиньи СПЭВ. Культуры получены из лаборатории культур тканей ГУ НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского. Клетки выращивали в виде монослоя в 48-луночных планшетах при 37 ?С в атмосфере 5% СО2 с использованием среды Игла МЕМ с добавлением антибиотиков (100 Ед/мл пенициллина и стрептомицина 50 МЕ/мл), глутамина 300 мкг/мл и  10% сыворотки крови эмбрионов коров (ростовая среда). В качестве поддерживающей использовали среду Игла с добавлением антибиотиков (100 Ед/мл пенициллина и стрептомицина 50 МЕ/мл), глутамина 300 мкг/мл и  2% инактивированной при 56 ?С сыворотки крови эмбрионов коров.

Препараты. В работе использовали следующие препараты: интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный, Р N003726/01, производства ООО «Фармапарк», Россия, активность 4*108 МЕ/мл; унитиол (димеркаптопропансульфонат натрия) Р N003207/01, производства ФГУП «Технолог СКТБ», Россия; таурин (аминоэтансульфоновая кислота), Р N000151/01, производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства, Россия; аскорбиновая кислота, Р N002030/01, производства ООО «Полисинтез», Россия; витамин E (dl – альфа-токоферола ацетат, тип CWS/F500 (водорастворимая форма), концентрация 500 МЕ/г.

В качестве референсного препарата активности интерферона альфа-2b человеческого рекомбинантного использовали  международный стандарт активности интерферона (WHO International Standard Interferon alpha 2b, NIBSC code: 95/566). 

Для  постановки тестов из вышеперечисленных препаратов готовили растворы, используя в качестве растворителя  поддерживающую среду. Интерферон альфа-2b изучали в концентрации  1000 МЕ/мл, 2000 МЕ/мл, 5000 МЕ/мл и  10000 МЕ/мл; унитиол  в концентрации 25 мг/мл, 12,5 мг/мл, 6,25 мг/мл, 5 мг/мл и 3,125 мг/мл, таурин в концентрации 250 мкг/мл, 125 мкг/мл, 62,5 мкг/мл и 31,1 мкг/мл. Растворы аскорбиновой кислоты в концентрации 100 мкг/мл, 50 мкг/мл, 25 мкг/мл и 12,5 мкг/мл, корректировали по рН  до значения 5,5 при помощи 2% раствора гидрокарбоната натрия. Альфа-токоферола ацетат (витамин Е)  использовали в виде растворов с концентрацией 1,0 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 0,05 мкг/мл и 0,01 мкг/мл. Перед определением противовирусной активности была проведена оценка цитотоксичности исследуемых растворов перечисленных концентраций по стандартной методике: исследуя морфологию и жизнеспособность клеток в монослое после 72 часов инкубации с растворами препаратов, при отсутствии изменений качества клеток в монослое, растворы препаратов считали не цитотоксичными.

Изучение противовирусной активности препаратов и их комбинаций. Оценку противовирусной активности препаратов и их комбинаций проводили в соответствии с рекомендациями [6,11, 14].

Для оценки противовирусного действия препаратов или их комбинаций в отношении вируса гриппа А/H5N1 в работе использовали 2-х суточный монослой культуры клеток MRC5, выращенный в стандартных 48-луночных планшетах. Полностью сформированный монослой клеток заражали вирусом гриппа А/H5N1 с инфекционной активностью 1 ТЦД50/лунку в объёме 25 мкл на лунку. После сорбции в течение 1 часа вируссодержащий материал удаляли, монослой клеток отмывали от неадсорбировавшегося вируса средой Игла МЕМ и вносили растворы препаратов или их комбинаций, приготовленные на поддерживающей среде, как описано ранее, в количестве 200 мкл. Планшеты инкубировали в течение 96 часов в атмосфере 5% СО2  при температуре 37°С,, для подсчета количества жизнеспособных клеток использовали метод окрашивания  0,1% спиртовым раствором метиленового синего. Противовирусную активность препаратов и их комбинаций оценивали путем сравнения их влияния на жизнеспособность  инфицированных клеток в сравнении с культурой  инфицированных клеток без растворов препаратов. Учет воздействия веществ на процессы репликации вируса производили только в случае, если в интактных клетках отсутствовала клеточная дегенерация и при развитии практически 100% цитопатического действия вируса в контрольных инфицированных клетках.

Изучение противогерпесвирусной активности препаратов как  отдельно взятых, так  и в комбинациях, проводили на культуре клеток Vero E6 в отношении трёх различных вариантов вируса простого герпеса по общепринятому методу [6, 11]. Культуру клеток выращивали в  стандартных 96-луночных планшетах в течение 2-3 суток. После формирования плотного монослоя среду роста удаляли, клетки заражали разведением вируса, соответствующим  100 ТЦИД50/клетку.  Планшеты  инкубировали в течение 60 минут в атмосфере 5% СО2  при температуре 37°С, затем инокулум удаляли и добавляли последовательные двукратные разведения растворов изучаемых препаратов на поддерживающей среде, каждый препарат исследовали в четырёх повторах. Планшеты инкубировали в атмосфере 5% СО2  при температуре 37°С,  через 48 часов проводили оценку цитопатического действия вируса и оценку ингибирующего действия веществ на развитие вирусиндуцированного ЦПД.  За 100% поражение принимали полное развитие вирусиндуцированного ЦПД на поверхности клеточного монослоя. Концентрацию вещества, обеспечивающую защиту клеточного монослоя от развития вирусиндуцированного ЦПД в 50% лунок, обозначали как ИД50. Учет воздействия веществ на репликацию вируса в культуре клеток проводили только в случае отсутствия клеточной дегенерации в лунках контроля качества клеточного монослоя и при развитии 100% поражения клеточного монослоя в контрольных лунках, соответствующих инфекционной дозе вируса 100 ТЦИД50/клетку.

Статистическую обработку результатов проводили по методу Спирмена-Кербера, используя формулу:

 где Dmax двоичный логарифм шага разведения, выше которого произошла 100 % защита;

d – двоичный логарифм шага разведения (1,0);

n – число лунок на каждую дозу (4);

р –число лунок, давших защиту в  Dmax  и последующих разведениях.

Для оценки эффективности комбинации различных препаратов в отношении вируса простого герпеса использовали понятие фракционного ингибирующего коэффициента (ФИК), значение которого вычисляли по формуле:

 При значении ФИК 0,5 имеет место умеренный синергизм соединений, при значении ФИК равном 1,0 -1,5 имеет место аддитивный эффект комбинации, при значении ФИК более 2 имеет место антагонизм соединений [15].

Результаты

Результаты оценки противовирусного действия препаратов и их комбинаций в отношении вируса гриппа А/H5N1 представлены в таблицах 1 и 2. Максимальный противовирусный эффект препаратов наблюдали при заражении культур клеток вирусом гриппа А/H5N1 с инфекционной множественностью              0,1 ТЦД50/лунку. При этом в контрольных лунках процент жизнеспособности клеток на четвертые сутки после заражения не превышал 9%, в то время как в  присутствие различных концентраций препаратов наблюдали увеличение жизнеспособности клеток от 10% до 100% (Таблица 1).

Таблица 1. Противовирусная активность препаратов в отношении вируса гриппа птиц А H5N1 на культуре клеток MRC5.

Доза вируса

ТЦД50/лунку

Количество  жизнеспособных клеток в монослое на 4 сутки после заражения, %
Альфа-токоферола ацетат (витамин Е) мкг/мл Таурин мкг/мл Унитиол мг/мл Аскорбиновая кислота мкг/мл Интерферон альфа-2b Контроль дозы вируса Контроль клеток
1,0 0,1 0,05 0,01 250 125 62,5 31,1 25 12,5 6,25 5 3,125 100 50 25 12,5 2000 10000
10,0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100
1,0 35 0 0 0 0 0 0 0 т т т 50 45 30 5 0 0 20 45 0 100
0,1 100 90 85 75 10 15 10 9 т т т 100 45 95 90 80 70 85 90 9 100

 Примечание: т- цитоксичность указанной концентрации раствора препарата. 0 — отсутствие живых клеток в монослое, 100 — полная защита клеточного монослоя от цитопатического действия вируса.

Так, например интерферон альфа-2b защищал монослой культуры клеток в концентрации 2000 МЕ/мл или 10000 МЕ/мл на 85% и 90% соответственно. Унитиол в концентрации  от 3,125 мг/мл до 25 мг/мл защищал культуру клеток  от 45% до 100 % соответственно. Высокой противовирусной активностью обладали растворы аскорбиновой кислоты: разные концентрации от 12,5 мкг/мл до 100 мкг/мл приводили к защите от 70% до 95% клеток соответственно.  Раствор альфа-токоферола ацетата (витамин Е) в концентрации 1,0 мкг/мл приводил к 100% защите клеточного монослоя от цитопатического действия вируса, меньшие концентрации  защищали культуру клеток от 75% до 90%. Таурин в концентрации от 31,1 мкг/мл до 250 мкг/мл  не обладал сколько-нибудь существенной противовирусной активностью, выражаемой в увеличении количества жизнеспособных клеток.

Изучение противовирусной активности комбинаций интерферона альфа-2b с другими препаратами – альфа-токоферола ацетатом (витамин Е), таурином, унитиолом и аскорбиновой кислотой в отношении вируса гриппа А/H5N1 проводили при инфекционной множественности заражения вируса 1,0 ТЦД50/лунку. Было установлено, что использование интерферона альфа-2b в концентрации 1000 МЕ/мл и 10000 МЕ/мл в комбинации с раствором альфа-токоферола ацетата (витамин Е), унитиола или аскорбиновой кислоты позволило повысить противовирусную активность интерферона в несколько раз (Таблица 2), то есть наблюдали синтергидный эффект при   комбинированном использовании препаратов. В комбинации интерферона альфа-2b  и таурина не наблюдали не только синергидного эффекта комбинации, но и аддитивного действия субстанций: противовирусная активность интерферона альфа-2b  как в комбинации с таурином так и без него была одной и той же (Таблица 2).

Таблица 2. Противовирусная активность комбинаций препаратов в отношении вируса гриппа птиц А H5N1 с множественностью заражения 1,0 ТЦД50/лунку на культуре клеток MRC5.

Наименование препарата и его концентрация Количество  жизнеспособных клеток в монослое на 4 сутки после заражения, %
Концентрация интерферона альфа-2b Е/мл Контроль дозы вируса Контроль клеток
0 1000 2000 5000 10000
Альфа-токоферола ацетат (витамин Е)

1,0 мкг/мл

25 45 55 65 70 0 100
Таурин

250 мкг/мл

0 10 10 30 40 0 100
Унитиол

3,125 мг/мл

45 55 65 70 85 0 100
Аскорбиновая кислота

100 мкг/мл

20 35 45 55 65 0 100
Без препаратов 0 20 30 40 45 0 100

Данные анализа противогерпетической активности препаратов представлены в Таблице 3. Проанализировав результаты изучения противовирусной активности препаратов в отношении вариантов вируса простого герпеса, в том числе вариантов вируса с лекарственной устойчивостью к ацикловиру (клинический изолят Avd) можно сделать вывод о том, что  унитиол, аскорбиновая кислота и альфа-токоферола ацетат (витамин Е) обладают прямой противогерпесвирусной активностью, в отличии от таурина, который такими свойстваами не обладает в исследуемом диапазоне концентраций.

Изучая противовирусную активность комбинаций интерферона альфа-2b с  – альфа-токоферола ацетатом (витамин Е), таурином, унитиолом и аскорбиновой кислотой в отношении вируса простого герпеса было установлено, что использование интерферона альфа-2b в концентрации 1000 МЕ/мл и 10000 МЕ/мл в комбинации с раствором альфа-токоферола ацетата (витамин Е), унитиола или аскорбиновой кислоты позволяет  повысить противовирусную активность интерферона.  В комбинации интерферона альфа-2b  и таурина не наблюдали не только синергидного эффекта комбинации, но и аддитивного действия при комбинации субстанций: интерферон альфа-2b  как в комбинации с таурином так и без обладал одной и той же противовирусной активностью.

Таблица 3.

Цитотоксическое действие и антигерпесвирусная активность изучаемых препаратов.

Препарат Единица измерения концентрации

ИД50

Вариант ВПГ

Л2 F(+) Avd
Унитиол мкг/мл 297,30 594,60 353,55
Таурин мкг/мл 0* 0* 0*
Интерферон альфа-2b МЕ/мл 2973,01 5946,03 2500,00
Аскорбиновая кислота мкг/мл 74,32 88,38 62,5
Альфа-токоферола ацетат (витамин Е) мкг/мл 1,3 2,2 1,5

 Примечание:  0* означает отсутствие противовирусной активности соединения в выбранном диапазоне концентраций без прямого цитотоксического действия на клетки.

Проанализировав полученные результаты мы пришли к заключению, что антиоксиданты унитиол и аскорбиновая кислота не только обладают прямой противогерпесвирусной активностью в культуре клеток, но и составляют эффективные комбинации с интерфероном альфа-2b, причем при комбинировании унитиола или аскорбиновой кислоты с  интерфероном альфа-2b наблюдается выраженный синергидный эффект: в присутствии указанных соединений концентрация интерферона альфа-2b, которая предотвращает развитие вирусиндуцированного цитопатического действия в 50% лунок снижается в несколько раз в зависимости от концентрации антиокидантов. Например, при комбинировании интерферона альфа-2b с унитиолом удалось добиться снижения концентрации в пять с лишним раз, при этом значение ФИК составило в среднем 0,3, что свидетельствует о выраженном синергизме соединений. Для сравнения при комбинировании интерферона альфа-2b и аскорбиновой кислоты  ИД50 интерферона альфа-2b снижается практически в 6 раз, а значение ФИК в среднем составляет 0,23, что показывает выраженный синергизм соединения. Относительно активности комбинации интерферона альфа-2b и таурина не выявлено влияния присутствия таурина на специфическую противогерпесвирусную активность интерферона альфа-2b: в присутствии различных концентраций таурина специфическая противогерпетическая активность интерферона альфа-2b соответствовала таковой чистой субстанции. Полученные данные согласуются с данными литературы об антиокислительной активности соединений: альфа-токоферола ацетат является одним из самых сильных природных антиоксидантов, аскорбиновая кислота является одним из самых сильных водорастворимые антиоксидантов, способна блокировать свободные радикалы и предотвращать дальнейшее развитие ПОЛ. Антиокислительная активность унитиола несколько слабее, механизм действия унитиола связан с его способностью   блокировать перекиси, образующиеся в процессе ПОЛ, а так же  связывать ионы металлов переменной валентности подобно комплексону. Относительно антиокислительной активности таурина  и механизме его действия как антиоксиданта в литературе не найдено достаточно объективных данных.

Выводы

Установлено, что используемые в работе антиоксиданты альфа-токоферола ацетат (витамин Е), унитиол и  аскорбиновая кислота обладают выраженным противогриппозным и противогерпетическим  действием в отношении вируса гриппа А/H5N1 и вариантов вируса простого герпеса in vitro. Растворы препаратов в различных концентрациях позволяют защитить до 100% клеточного монослоя от цитопатического действия вируса. Растворы таурина не проявляли противовирусной активности  ни при множественности заражения 1,0 ТЦД50/лунку, так и при снижении инфекционности вируса до 0,1 ТЦД50/лунку.

Комбинация интерферона альфа-2b  и альфа-токоферола ацетата (витамин Е), унитиола или аскорбиновой кислоты обладала явно выраженным синергидным эффектом: при совместном использовании противовирусная активность интерферона увеличивалась в несколько раз. В отличие от вышеперечисленных сильных антиоксидантов таурин в сочетании с  интерфероном альфа-2b не оказывал синергидного влияния на противовирусную активность последнего: противогриппозная активность интерферона не изменялась в присутствии различных концентраций таурина.

Полученные данные свидетельствуют о высокой антиокислительной активности альфа-токоферола ацетата (витамин Е), унитиола и аскорбиновой кислоты, что согласуется с данными литературы, где подробно описан механизм антиокислительного действия этих веществ. Объективных данных об антиокислительной активности таурина и механизмах его антиокислительного действия, как в отечественной, так и в зарубежной  литературе не найдено, что подтверждается данными об отсутствии его противовирусной активности  в используемой модели вирусной инфекции.

Заключение

Результаты проведенного исследования дают основание рекомендовать включения препаратов интерферона альфа-2b человеческого рекомбинантного в комбинации с высокоактивными антиоксидантами альфа-токоферола ацетатом (витамин Е), аскорбиновой кислотой или унитиолом в схему лекарственной терапии гриппозной  и герпетической инфекции.

Литература:
1. Амвросьева Т.В., Вотяков В.И., Андреева О.Т. Дислепидемия, повышенное содержание в клетках липидов при экспериментальной герпесвирусной инфекции и их коррекция антивирусными химиопрепаратами//Вопросы вирусологии.-1992.-№1.-С.61-64.
2. Васильев А.Н. Оценка влияния антиоксидантов на специфическую противовирусную активность интерферона альфа-2b человеческого рекомбинантного в отношении вируса простого герпеса в культуре клеток.//Антибиотики и химиотерапия.-201.-№55.-С.7-8.
3. Галегов Г. А., Андронова В. Л., Леонтьева Н. А., Львов Н. Д., Петрова И. Г. Этиотропная лекарственная терапия вирусных инфекций//Вопросы вирусологии.-2004.-№3.-С.35-40.
4. Галегов Г.А. Лекарственная терапия герпес — вирусной инфекции: фундаментальные аспекты и современные клинические достижения//Consilium Medicum.-2002.-Т.4.- №5.-С.240-243.
5. Красавина Б.С., Майчук Ю.Ф., Долгат Л.Д., Ромащенко А.Д. Влияние водорастворимого антиоксиданта оксипиридина-6 на интенсивность процессов перекисного окисления липидов мембран тканей глаза при экспериментальном офтальмогерпесе//Бюлл. эксп. биол. и мед.-1982.-№7.-С.731-740.
6. Львов Д.К., Федякина И.Т., Щелканов М.Ю. и др. Действие ин витро противовирусных препаратов на репродукцию высокопатогенных штаммов вируса гриппа А/H5N1, вызвавших эпизоотию среди домашних птиц летом 2005 г. // Вопросы вирусологии. -2006.-№2.-С.
7. Львов Н. Д., Андpонова В. Л., Леонтьева Н. А., Галегов Г. А. Изоляция из клинического материала штаммов вируса герпеса простого, обладающих pезистентностью к ацикловиру//Вопросы вирусологии.-1999.-№6.-С.247-249.
8. Львов Н.Д., Самойлович Е.О., Баринский И.Ф. Комбинированная терапия герпесвирусной инфекции, экспериментальные и клинические данные//Вопросы вирусологии.-1992.-№1.-С.8-16.
9. Никонова А.П., Асцатурова О.Р. Генитальный герпес и беременность.// Инфекции и антимикробная ьерапия.-1999.-№3.-С.77-80.
10. Онищенко Г.Г. Ситуация по заболеваемости гриппом в мире и в Российской Федерации. Совершенствование надзора и контроля за гриппом при подготовке к возможной пандемии. Документы Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
11. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. / Под ред Р. У. Хабриева, М.: 2005.
12. Темичева Е.В. Интерфероновый статус при рецидивирующем герпесе гениталий и коррекция его нарушений: Автореф.дисс…канд.мед.наук.-М.,1989.
13. Темичева Е.В., Малиновская В.В., Манахова Л.С. и др. //Вопросы вирусологии/-1986/-№1.-C.12-18.
14. Федякина И.Т., Ленёва И.А., Ямникова С.С. и др. Чувствительность вирусов гриппа А /Н5N1, изолированных от диких птиц на территории России, к арбидолу в культуре клеток MDCK// Вопросы вирусологии.- 2005.- №6.- c. 22-25
15. De Clercq E., Sakuma T.. Baba M.. Pauwels R., Balzarini J., Rosenberg I., Hol? A. Antiviral activity of phosphonylmethoxyalkyl derivatives of purine and pyrimidines//Antiviral research.-1987.-Vol.8.-№5-6.-Р.261-272.
[/member]