Васильев А.Н.
Федеральное Государственное Учреждение Научный центр экспертизы средств медицинского применения. Институт доклинической и клинической экспертизы лекарственных средств. (ИДКЭЛС ФГУ НЦЭСМП)
Работа выполнена в Научно-исследовательском институте вирусологии имени Д.И. Ивановского РАМН.
В работе получены данные, свидетельствующие о синергидном противовирусном эффекте in vitro комбинации интерферона альфа-2b и антиоксиданта унитиола в отношении различных вариантов вируса простого герпеса, в том числе в отношении клинических изолятов вируса с лекарственной устойчивостью к ацикловиру. Показано, что антиоксидант унитиол обладает прямой противогерпесвирусной активностью в культуре клеток, однако его активность менее выражена, чем активность другого сильного антиоксиданта – аскорбиновой кислоты. Так же выявлено, что в присутствии унитиола специфическая противогерпесвирусная активность интерферона альфа-2b увеличивается в несколько раз. Полученные в работе данные могут быть применены в клинической практике, поскольку использование комбинаций препаратов или комплексных препаратов позволяет повышать эффективность проводимой терапии герпетической инфекции, добиваясь большего эффекта при тех же концентрациях действующих лекарственных средств.
Генитальный герпес является одной из наиболее распространенных форм инфекции вируса простого герпеса (ВПГ – инфекции) среди взрослого населения. В России ежегодно ВПГ инфицируется около 10 млн. населения, в последние годы отмечена тенденция к увеличению заболеваемости генитальной формой ВПГ-инфекции, что имеет особую значимость в гинекологической и акушерской практике. Развитие ВПГ-инфекции может иметь тяжелые последствия для здоровья матери и ребенка, выражаемые в развитии бесплодия, различных патологий беременности, а так же тяжелых заболеваниях новорожденных (7, 10). Таким образом, ВПГ-инфекцию можно считать важной медико-социальной проблемой современного здравоохранения.
На сегодняшний день основным направлением лечения ВПГ-инфекции является химиотерапия (2, 3), однако способность вирусов к формированию устойчивых к химиопрепаратам штаммов существенно снижает её эффективность. Метод комбинированной терапии вирусных заболеваний довольно распространен, использование препаратов с разными механизмами действия позволяет получать устойчивый эффект при снижении терапевтической дозы препаратов, а так же снизить вероятность получения мутантов вируса с лекарственной устойчивостью (6, 12, 13). Препараты интерферона прочно заняли свое место в арсенале практикующих врачей благодаря универсальному механизму противовирусного действия. Поиск препаратов, позволяющих повысить эффективность интреферонотерапии, проводится довольно давно, разработаны и используются в клинической практике комбинации препаратов интерферона альфа-2b и модифицированных нуклеозидов (12,13).
В последнее время опубликовано множество работ об участии процесса перекисного окисления липидов мембран (ПОЛ) и системы антиокислительной защиты организма (АОЗ) в патогенезе вирусных и бактериальных инфекций, а так же в развитии многих других заболеваний (1, 4). Дисбаланс ПОЛ-АОЗ на местном уровне осложняет течение вирусных инфекций, следовательно, применение препаратов, обладающих антиокислительными свойствами, позволяет восстановить баланс процессов ПОЛ-АОЗ и облегчить течение вирусной инфекции (1,4, 9). Ранее была изучена противогерпесвирусная активность комбинаций интерферона альфа-2 человеческого рекомбинантного и антиоксидантов токоферола ацетата и аскорбиновой кислоты in vitro и in vivo, показано наличие выраженного синергизма между препаратами (8, 9): в присутствии аскорбиновой кислоты и токоферола ацетата специфическая противовирусная активность интерферона альфа увеличивалась в несколько раз.
Целью настоящей работы явилось изучение in vitro противовирусной активности сочетаний интерферона альфа-2b человеческого рекомбинантного и серосодержащих антиоксидантов таурина и унитиола в отношении различных вариантов вируса простого герпеса, в том числе клинических изолятов вируса простого герпеса, выделенных от больных.
Методика исследования.
Вирусы. В работе использовали четыре варианта вируса простого герпеса, из них два эталонных штамма и два клинических изолята. ВПГ-1/Л2 – вирус простого герпеса тип 1, штамм Л2. ВПГ-1/(F+) вирус простого герпеса тип 1, штамм (F+ ). Штаммы получены из Государственной коллекции вирусов ГУ НИИ Вирусологии им. Ивановского РАМН. Инфекционный титр вирусов в культуре клеток Vero по нашим данным составил 6,0-6,5 lg ТЦИД50/мл. ВПГ-1 изолят avd. Вирус выделен в 2006 году от больного рецидивирующим ВПГ. По антигенной структуре, по данным МФА а, так же по наличию специфического цитопатического эффекта в культуре клеток Vero (образование синцитиев) вирус подобен ВПГ-1. ВПГ-1 изолят Shash. Вирус выделен в 2006 году от больного рецидивирующим ВПГ. По антигенной структуре, по данным МФА а так же по наличию специфического цитопатического эффекта в культуре клеток Vero (образование синцитиев) вирус подобен ВПГ-1. Указанные изоляты ВПГ относятся к ацикловирезистентным штаммам. Методика изоляции вирусов указана в работе (5). До начала исследования вирусы прошли по 5 пассажей на культуре клеток, хранение вирусного материала осуществляли в пробирках типа Eppendorf при температуре (-70°С).
Клетки. В работе использовали культуру клеток почки африканской зеленой мартышки, Vero Е6 (Vero E6), получена из коллекции культур тканей ГУ НИИ Вирусологии им. Ивановского РАМН. Клетки культивировали на среде Игла DМЕМ с двойным набором аминокислот или на среде RPMI с добавлением 10% сыворотки крови эмбрионов коров (HyClone Standard Fetal Bovine Serum, Thermo Fisher Scientific Inc, США или другая аналогичного качества) и глютамина в количестве 300 мкг/мл. В качестве антибиотиков использовали смесь пенициллина в количестве 100 мкг/мл и стрептомицина 50 МЕ/мл или гентамицин в количестве 100 мкг/мл. Процедура пересева заключалась в снятии монослоя клеток смесью трипсина 0,25% и версена 0,02% в соотношении 1:2. Оптимальная плотность пересева 1,0-3,0*105 клеток на 1 мл. Среда поддержки: среда Игла DМЕМ с двойным набором аминокислот или среда RPMI с антибиотиками и глутамином аналогично среде роста с добавление 2% инактивированной при 56°С в течение 1 часа сыворотки крови эмбрионов коров.
Препараты. Интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный, субстанция (ФСП, производства ООО «Фармапарк», Россия). Димеркаптопропансульфонат натрия, под торговой маркой Унитиол, субстанция (ФСП 42-0348-4718-03, производства ФГУП «Технолог СКТБ», Россия) и препарат Унитиол (ФСП42-0024131-03, производства ОАО «Мосхимфармпрепараты им. Н.А. Семашко, Россия). Аминоэтансульфоновая кислота под торговой маркой Таурин, субстанция (ФСП 42-0550-0044-04, производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства, Россия) и препарат Тауфон глазные капли 4% (ФСП42-0087-6550-05, производства Московский эндокринный завод, Россия). В качестве препарата сравнения использовали Аскорбиновую кислоту, субстанция (ФСП, производства). В качестве референсного препарата активности интерферона альфа-2 человеческого рекомбинантного использовали международный стандарт активности интерферона (WHO International Standard Interferon alpha 2b, NIBSC code: 95/566 (МСО)).
Для работы на культуре клеток из субстанций препаратов готовили растворы на поддерживающей среде в концентрации 2 мг/мл, приготовленные растворы выдерживали при комнатной температуре в течение 24 ч, для аскорбиновой кислоты проводили коррекцию рН раствором гидрокарбоната натрия 2 % до рН 5,5, затем приготовленные растворы подвергали стерилизующей фильтрации через насадки фирмы Millipore с фильтром Durapore из эфиров целлюлозы. Препараты в виде готовых лекарственных средств разводили на поддерживающей среде до нужной концентрации.
Оценка цитотоксического действия препаратов. Оценку воздействия различных концентраций веществ и определение 50% тканевой цитотоксической концентрации веществ (ТЦД50) и максимальную переносимую концентрацию вещества (МПК) проводили следующим образом: к сформированному в стандартных 96-луночных планшетах клеточному монослою добавляли последовательные двукратные разведения приготовленных растворов препаратов на поддерживающей среде, затем клетки культивировали при 37°C в атмосфере 5 % СО2 в течение 2-5 дней. О воздействии вещества на морфологию клеток и их жизнеспособность судили по наличию изменений в структуре клеток, включающих следующие признаки: нарушение целостности монослоя, округление клеток, набухание или напротив сжатие клеточных мембран, грануляция и вакуолизация цитоплазмы клеток. За 50% тканевую цитотоксическую концентрацию вещества (ТЦД50) принимали такую концентрацию, которая вызывала цитотоксические изменения в 50% клеток на 4 сутки наблюдения, за максимальную переносимую концентрацию вещества (МПК) – принимали концентрацию вещества, воздействие которой не вызывало видимых цитодеструктивных изменений клеточного монослоя.
Изучение противогерпесвирусной активности препаратов. Изучение противогерпесвирусной активности препаратов как отдельно взятых, так и в комбинациях, проводили на культуре клеток Vero E6 в отношении четырёх различных вариантов вируса простого герпеса по общепринятому методу (6, 11). Культуру клеток выращивали в стандартных 96-луночных планшетах (Nunk или Corninc Costar, США) в атмосфере 5% СО2 при температуре 37°С в течение 2-3 суток. После формирования плотного монослоя среду роста удаляли, клетки заражали разведением вируса, соответствующим 100 ТЦИД50/клетку. Планшеты инкубировали в течение 60 минут в атмосфере 5% СО2 при температуре 37°С, затем инокулум удаляли и добавляли последовательные двукратные разведения растворов изучаемых препаратов на поддерживающей среде, каждый препарат исследовали в четырёх повторах. Планшеты инкубировали в атмосфере 5% СО2 при температуре 37°С, через 48 часов проводили оценку цитопатического действия вируса и оценку ингибирующего действия веществ на развитие вирусиндуцированного ЦПД. За 100% поражение принимали полное развитие вирусиндуцированного ЦПД на поверхности клеточного монослоя. Концентрацию вещества, обеспечивающую защиту клеточного монослоя от развития вирусиндуцированного ЦПД в 50% лунок, обозначали как ИД50. Учет воздействия веществ на репликацию вируса в культуре клеток проводили только в случае отсутствия клеточной дегенерации в лунках контроля качества клеточного монослоя и при развитии 100% поражения клеточного монослоя в контрольных лунках, соответствующих инфекционной дозе вируса 100 ТЦИД50/клетку.
Статистическую обработку результатов проводили по методу Спирмена-Кербера, используя формулу:
где Dmax двоичный логарифм шага разведения, выше которого произошла 100 % защита;
d – двоичный логарифм шага разведения (1,0);
n – число лунок на каждую дозу (4);
р –число лунок, давших защиту в Dmax и последующих разведениях.
В качестве оценки цитотоксичности и противовирусной активности соединений использовали понятие химиотерапевтического индекса (ХТИ), вычисляемого как отношение МПК к ИД50. Согласно данным литературы для химиотерапевтического препарата значение ХТИ должно быть более или равно 3.
Определение противогерпетической активности комбинации соединений in vitro проводили по методу (12) путем определения противогерпетичской активности комбинации соединений по сравнению с противовирусной активностью вещества при использовании его не в комбинации. Для оценки эффективности комбинации использовали понятие фракционного ингибирующего коэффициента (ФИК), значение которого вычисляли по формуле:
При значении ФИК 0,5 имеет место умеренный синергизм соединений, при значении ФИК равном 1,0 -1,5 имеет место аддитивный эффект комбинации, при значении ФИК более 2 имеет место антагонизм соединений. Для наглядной интерпретации результатов определения ИД50 двух веществ в комбинации строили изоболограммы: по оси абсцисс откладывали концентрации ИД50 одного вещества в комбинации, по оси ординат откладывали концентрации ИД50 другого вещества в комбинации. В этих координатах строили кривую, точки которой соответствовали 50% ингибированию вирусиндуцированного ЦПД комбинации веществ в соответствующих концентрациях. Синергидный противовирусный эффект комбинации веществ выражался в наличии экспоненциальной зависимости, радиус кривизны которой был направленной к центру оси координат, при наличии линейной зависимости эффект комбинации соединений приближался к аддитивному. При наличии экспотенциальной зависимости, радиус кривизны которой был направлен вверх – в противоположную от центра оси координат сторону, проявлялся антагонистический эффект комбинации веществ.
Результаты исследования.
Первоначально нами было оценено цитотоксическое действие соединений на культуру клеток Vero Е6. Установлено, что степень выраженности цитоксического воздействия соединений на культуру клеток зависит от концентрации препаратов, полученные данные представлены в таблице 1. Рабочий диапазон концентраций для работы на выбранной культуре клеток для интерферона альфа-2b менее 35000 МЕ/мл, для унитиола и таурина менее 1486,5 мкг/мл, для аскорбиновой кислоты менее 370,0 мкг/мл, при использовании концентраций препаратов ниже указанных процент жизнеспособности клеток через 96 ч наблюдения не отличался от такового в контроле.
Далее нами была изучена прямая противогерпесвирусная активность антиоксидантов, как в отношении эталонных штаммов, так и в отношении клинических изолятов вируса простого герпеса, полученные результаты так же представлены в таблице 1.
Проанализировав результаты изучения цитоксичности и противовирусной активности препаратов можно сделать вывод о том, что исследуемый препарат унитиол и препарат сравнения аскорбиновая кислота обладают прямой противогерпесвирусной активностью, в отличии от таурина, который не обладал прямой противогерпесвирусной активностью в исследуемом диапазоне концентраций. Выявлено, что противогерпетическая активность антиоксидантов унитиола и аскорбиновой кислоты носит избирательный и дозозависимый характер: вещества проявляют свою противовирусную активность в диапазоне не цитотоксичных концентраций и могут применяться для лечения герпетической инфекции в качестве химиопрепаратов: ХТИ унитиола равен 3,16, ХТИ аскорбиновой кислоты 5,99. Как видно из результатов исследования препарат таурин не обладает прямой противогерпесвирусной активностью.
Таблица 1.
Цитотоксическое действие и антигерпесвирусная активность изучаемых препаратов.
| Препарат | Единица измерения концентрации | МПК | ТЦД50 | ИД50 | ЭД100 | ХТИ (среднее значение) | |||
| Вариант ВПГ | Вариант ВПГ | ||||||||
| Л2 | F(+) | Avd | Sash | Л2 | |||||
| Унитиол | мкг/мл | 1486,50 | 749,61 | 297,30 | 594,60 | 353,55 | 250,0 | 781,00 | 3,97 |
| Таурин | мкг/мл | 625,00 | 841,97 | 0* | 0* | 0* | 0* | 0 | 0 |
| Интерферон альфа-2b | МЕ/мл | 36865,42 | 1189207 | 2973,01 | 5946,03 | 2500,00 | 3535,53 | 6200,00 | 9,86 |
| Аскорбиновая кислота | мкг/мл | 374,80 | 420,71 | 74,32 | 88,38 | 62,5 | 62,5 | 250,00 | 5,21 |
Примечание
: 0* означает отсутствие противовирусной активности соединения в выбранном диапазоне концентраций без прямого цитотоксического действия на клетки.
Следующим этапом нашей работы было изучение противогерпетической активности комбинаций интерферона альфа-2b и антиоксидантов в культуре клеток в отношении эталонного варианта вируса простого герпеса штамм Л2. По результатам изучения были так же построены изоболограммы, наглядно иллюстрирующие характер взаимодействия соединений, а так же вычислен ФИК. Результаты исследования представлены в виде изоболограмм на рисунках 1 и 2.
Проанализировав полученные результаты мы пришли к заключению, что антиоксиданты унитиол и аскорбиновая кислота не только обладают прямой противогерпесвирусной активностью в культуре клеток, но и составляют эффективные комбинации с интерфероном альфа-2b, причем при комбинировании унитиола или аскорбиновой кислоты с интерфероном альфа-2b наблюдается выраженный синергидный эффект: в присутствии указанных соединений концентрация интерферона альфа-2b, которая предотвращает развитие вирусиндуцированного цитопатического действия в 50% лунок снижается в несколько раз в зависимости от концентрации антиокидантов. Например, при комбинировании ИФН с унитиолом удалось добиться снижения концентрации в пять с лишним раз, при этом значение ФИК составило в среднем 0,3, что свидетельствует о выраженном синергизме соединений. Для сравнения при комбинировании ИФН и аскорбиновой кислоты ИД50 ИФН снижается практически в 6 раз, а значение ФИК в среднем составляет 0,23, что показывает выраженный синергизм соединения. Относительно активности комбинации ИФН и таурина не выявлено влияния присутствия таурина на специфическую противогерпесвирусную активность ИФН: в присутствии различных концентраций таурина специфическая противогерпетическая активности ИФН соответствовала таковой чистой субстанции. Полученные данные согласуются с данными литературы об антиокислительной активности соединений: аскорбиновая кислота является одним из самых сильных водорастворимые антиоксидантов, способна блокировать свободные радикалы и предотвращать дальнейшее развитие ПОЛ. Антиокислительная активность унитиола несколько слабее, механизм действия унитиола связан с его способностью блокировать перекиси, образующиеся в процессе ПОЛ, а так же связывать ионы металлов переменной валентности подобно комплексону. Относительно антиокислительной активности таурина и механизме его действия как антиоксиданта в литературе не найдено достаточно объективных данных.
Выводы.
Таким образом, применение препаратов ИФН в комплексе с активными антиоксидантами позволяет повысить противогерпесвирусную активность ИФН в пять и более раз, что может способствовать повышению эффективности проводимой терапии столь тяжело поддающейся лечению инфекции вируса простого герпеса. Отметим, что действие ИФН и антиоксидантов в отношении вируса простого герпеса носит избирательный дозозависимый характер и не зависит от варианта вируса герпеса: полученные результаты в отношении эталонных штаммов и клинических изолятов ВПГ коррелирут между собой.
Литература:
1. Амвросьева Т.В., Вотяков В.И., Андреева О.Т. Дислепидемия, повышенное содержание в клетках липидов при экспериментальной герпесвирусной инфекции и их коррекция антивирусными химиопрепаратами//Вопросы вирусологии.-1992.-№1.-С.61-64.
2. Галегов Г. А., Андронова В. Л., Леонтьева Н. А., Львов Н. Д., Петрова И. Г. Этиотропная лекарственная терапия вирусных инфекций//Вопросы вирусологии.-2004.-№3.-С.35-40.
3. Галегов Г.А. Лекарственная терапия герпес – вирусной инфекции: фундаментальные аспекты и современные клинические достижения//Consilium Medicum.-2002.-Т.4.- №5.-С.240-243.
4. Красавина Б.С., Майчук Ю.Ф., Долгат Л.Д., Ромащенко А.Д. Влияние водорастворимого антиоксиданта оксипиридина-6 на интенсивность процессов перекисного окисления липидов мембран тканей глаза при экспериментальном офтальмогерпесе//Бюлл. эксп. биол. и мед.-1982.-№7.-С.731-740.
5. Львов Н. Д., Андpонова В. Л., Леонтьева Н. А., Галегов Г. А. Изоляция из клинического материала штаммов вируса герпеса простого, обладающих pезистентностью к ацикловиру//Вопросы вирусологии.-1999.-№6.-С.247-249.
6. Львов Н.Д., Самойлович Е.О., Баринский И.Ф. Комбинированная терапия герпесвирусной инфекции, экспериментальные и клинические данные//Вопросы вирусологии.-1992.-№1.-С.8-16.
7. Маренникова С.С., Мацевич Г.Р., Чекунова Э.В. и др. Разработка и практическое использование новых экспериментальных моделей разных форм герпетической инфекции// Вопр. вирусол.-1986.-№1.-С.59-65.
8. Никонова А.П., Асцатурова О.Р. Генитальный герпес и беременность.// Инфекции и антимикробная ьерапия.-1999.-№3.-С.77-80.
9. Темичева Е.В., Малиновская В.В., Манахова Л.С. и др. //Вопросы вирусологии/-1986/-№1.-C.12-18.
10. Темичева Е.В. Интерфероновый статус при рецидивирующем герпесе гениталий и коррекция его нарушений: Автореф.дисс…канд.мед.наук.-М.,1989.
11. Blanebier H., Huraux-Rendu Gb. Genital herpes and pregnancy preventive measures. //European Journal of Obstetrics, gynecology and reproductive biology.-1994.-Vol.53.-№1.-P.33-38.
12. De Clercq E., Sakuma T.. Baba M.. Pauwels R., Balzarini J., Rosenberg I., Hol? A. Antiviral activity of phosphonylmethoxyalkyl derivatives of purine and pyrimidines//Antiviral research.-1987.-Vol.8.-№5-6.-Р.261-272.
Загрузка …
