Известно, что вирусы способны к фенотипической и генотипической изменчивости и постоянно формируют опасные для человеческой популяции варианты. Наибольшую проблему с точки зрения эпидемиологии представляет собой изменчивость вирусов гриппа [4]. Одним из механизмов формирования новых вариантов вируса гриппа является формирование реассоциатов в результате смешанного заражения. Наиболее частым источником образования новых вариантов вируса гриппа А являются водоплавающие и другие птицы [1, 4].
В настоящий момент Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) зафиксированы несколько вариантов вирусов гриппа птиц, способных инфицировать человека: штаммы вируса гриппа птиц А (H5N1) и A (H7N9) [1]. Впервые о заражении гриппом птиц A (H7N9) человека было сообщено 31 марта 2013 г. органами здравоохранения Китая, на сегодняшний день в ВОЗ поступили сообщения о 453 лабораторно подтвержденных случаях инфицирования людей вирусом птичьего гриппа A (H7N9), полученные от Национальной комиссии по здравоохранению и планированию семьи КНР, от Гонконгского Центра по охране здоровья и от Центров контроля заболеваний Тайбэя [1].
Несмотря на незначительное количество сообщений о заражении данным вирусом человека, вирус гриппа птиц A (H7N9) вызывает у врачей обеспокоенность в связи с тем, что у большинства пациентов заболевание протекало в тяжелой форме и в 175 случаях имело летальный исход [1]. Таким образом, своевременный поиск способов лечения данной инфекции является актуальной задачей.
Химиопрепараты против вируса гриппа представлены соединениями, оказывающими свое воздействие на разные стадии репликации вируса гриппа: препараты ремантадина блокируют белок М2 вируса гриппа. Препараты занамивир и осельтамивир действуют как ингибиторы нейраминидазы. В отношении препаратов группы ремантадина можно отметить их высокую токсичность и низкую эффективность, так как они активны только в отношении гриппа А, но не против гриппаВ. Ингибиторы нейраминидазы являются эффективными препаратами, но, имея высокую стоимость, менее доступны для населения.
В организме человека основной системой, ответственной за борьбу с вирусными инфекциями, является система интерферона. В арсенале современной медицины имеются препараты рекомбинантного интерферона альфа-2b, широкий спектр противовирусной активности которых характеризован в многочисленных исследованиях как in vitro, так и in vivo [5].
По данным различных исследователей эффективность терапии интерфероном альфа-2b вирусных инфекций можно значительно повысить при помощи антиоксидантов [2, 3, 7, 8]. Впервые о синергизме интерферона альфа-2b и антиоксидантов в терапии вирусных инфекций сообщалось в работах В. В. Малиновской. По данным [7, 8] комбинация интерферона альфа-2b и антиоксидантов iv vitro и in vivo имеет выраженный синергидный эффект: в присутствии антиоксидантов специфическая противовирусная активность интерферона увеличивается в несколько раз, что позволяет не только повысить эффективность терапии, но и снизить возможность проявления побочных эффектов.
Целью настоящей работы явилось изучение противовирусной активности интерферона альфа-2b как противовирусного препарата в отношении вируса гриппа птиц A (H7N9) и оценка влияния антиоксидантов на течение экспериментальной инфекции in vitro.
Материалы и методы исследования
Культура клеток
Линия клеток почки зеленой мартышки Vero клон Е6, получена из лаборатории культур тканей ФГБУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского. Культуру клеток выращивали в виде монослоя в 96-луночных планшетах при 37 °С в атмосфере 5% СО2 с использованием среды Игла МЕМ с добавлением антибиотиков (100 Ед/мл пенициллина и стрептомицина 50 МЕ/мл), глутамина 150 мкг/мл и 10% сыворотки крови эмбрионов коров (ростовая среда). В качестве поддерживающей использовали среду Игла с добавлением антибиотиков (100 Ед/мл пенициллина и стрептомицина 50 МЕ/мл), глутамина 150 мкг/мл и 2% инактивированной при 56 °С сыворотки крови эмбрионов коров.
Вирус
Штамм вируса гриппа птиц A/Anhui/2013 (H7N9) получен из лаборатории Государственной коллекции вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского. Для культивирования использовали алантоисную полость 9–10-дневных куриных эмбрионов.
Препараты
- Интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный, Р N003726/01, производства ООО «Фармапарк», Россия, активность 4 × 108 МЕ/мл. Обладает выраженной противовирусной, антипролиферативной и иммуномодулирующей активностью. В качестве референса активности интерферона альфа-2b человеческого рекомбинантного использовали международный стандарт активности интерферона (International Standard Interferon alpha 2b, NIBSC code: 95/566).
- Аскорбиновая кислота (витамин С), ЛС-000420, производства «ДСМ Нутришнл Продактс (ЮК) Лимитед», Великобритания. Является высокоактивным природным антиоксидантом, нейтрализует свободные радикалы, обладает способностью восстанавливать активную форму витамина Е.
- Аскорбат натрия, ЛС-000423, производства «ДСМ Нутришнл Продактс (ЮК) Лимитед», Великобритания. Является натриевой солью аскорбиновой кислоты, имеет аналогичную биологическую активность с аскорбиновой кислотой, но в отличие от нее обладает меньшим поверхностным раздражающим действием.
- Альфа-токоферола ацетат (витамин E), dl-альфатокоферола ацетат, тип CWS/F500, водорастворимая форма, производства Sigma Aldridsch, США. Является высокоактивным природным антиоксидантом и антигипоксантом, нейтрализует свободные радикалы и перекиси жирных кислот, активные формы кислорода, способен предотвращать перекисное окисление мембран клеток.
- Мексидол (этилметилгидроксипиридина сукцинат), P N002161/01, производства ООО «НПК Фармасофт», Россия. Является высокоактивным синтетическим антиоксидантом, нейтрализует свободные радикалы.
Цитотоксичность
Оценку цитотоксичности препаратов проводили по стандартной методике [6] путем инкубации 1-суточного монослоя клеточной культуры Vero клон Е6 с различными концентрациями препаратов в течение 72 часов в 96-луночных планшетах при 37 °С в атмосфере 5% СО2. После инкубации клетки отмывали раствором Хенкса, для подсчета количества клеток использовали автоматический счетчик клеток Cauntess, производства Invitrogen, США с применением 0,4% раствора трипанового синего. За ЦД50 (50% тканевая цитопатическая доза) испытуемого образца принимали максимальную концентрацию, способствующую выживанию не менее 50% клеток по сравнению с контролем. За МПК (максимально переносимая концентрация) испытуемого образца принимали максимальную концентрацию испытуемого образца, не вызывающую видимых изменений в жизнеспособности клеток.
Антивирусная активность
Антивирусную активность оценивали по уровню подавления цитопатического действия вируса различными разведениями препаратов и комбинаций на культуре клеток Vero клон Е6. Для работы использовали 1-суточный монослой культуры, выращенный в 96-луночных планшетах. Множественность инфицирования вируса гриппа птиц A/Anhui/2013 (H7N9) составила 0,1 ТЦД50 на клетку, продолжительность инкубации 48 часов при 37 °С в атмосфере 5% СО2. За ИК50 (50% ингибирующая концентрация) принимали концентрацию испытуемого образца, при которой клеточная культура оказалась полностью защищенной от цитопатического действия вируса в 50% лунок.
Результаты и обсуждение
Изучение цитотоксического действия препаратов
Определенные максимальные переносимые концентрации препаратов, не оказывающие цитотоксического действия на культуру клеток Vero клон Е6, приведены в табл. 1.
Для работы на культуре клеток при определении антивирусной активности использовали концентрации препаратов меньше или равные МПК, указанные в табл. 1.
Изучение антивирусной активности препаратов
Определенные для препаратов ИК50 в отношении вируса гриппа птиц A/Anhui/2013 (H7N9) представлены в табл. 1. Для оценки возможной перспективы использования препарата в качестве химиотерапевтического средства в отношении вирусной инфекции использовали понятие ХТИ (химиотерапевтический индекс) — отношение максимально переносимой концентрации препарата к ИК50. Для эффективных противовирусных препаратов величина ХТИ должна быть более 3. Полученные данные в отношении антивирусной активности исследуемых препаратов показывают, что интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный может быть использован в качестве средства противовирусной терапии инфекции, вызываемой вирусом гриппа птиц A/Anhui/2013 (H7N9). Также показано, что антиоксидант Мексидол обладает слабовыраженной противовирусной активностью со значением ХТИ 4,0.
Изучение антивирусной активности комбинаций препаратов
Для изучения влияния антиоксидантов на антивирусную активность интерферона альфа-2b готовили растворы исследуемых препаратов с различной концентрацией как интерферона альфа-2b, так и антиоксидантов. При значении ФИК 0,5 имеет место умеренный синергизм соединений, при значении ФИК, равном 1,0–1,5, имеет место аддитивный эффект комбинации, при значении ФИК более 2 имеет место антагонизм соединений [9]. Результаты оценки влияния антиоксидантов на антивирусную активность интерферона альфа-2b приведены в табл. 2.
Из представленных данных видно, что антиоксиданты оказывают стимулирующее действие на противовирусную активность интерферона альфа-2b: в присутствии разных концентраций антиоксидантов ИК50 интерферона альфа2b снижается в 2 и более раза. Так, например, в присутствии аскорбиновой кислоты в концентрации 25 мкг/мл ИК50 интерферона альфа-2b снижается в 8 раз, при использовании концентрации 2,5 мкг/мл — в 2 раза. В присутствии аскорбата натрия в концентрации 25 мкг/мл ИК50 интерферона альфа-2b снижается в 8 раз, при использовании концентрации 2,5 мкг/мл — в 4 раза. При использовании альфа-токоферола ацетата в концентрации 25 мкг/мл и 2,5 мкг/мл ИК50 интерферона альфа-2b снижается в 8 раз. При совместном использовании с Мексидолом в концентрации 25 мкг/мл ИК50 интерферона альфа-2b снижается в 8 раз, при использовании в концентрации 2,5 мкг/мл — в 4 раза.
При анализе эффекта комбинированного применения антиоксидантов и интерферона альфа-2b путем расчета ФИК получены данные, демонстрирующие явно выраженный синергидный эффект для всех комбинаций, причем максимальный синергидный эффект наблюдали при комбинировании с альфа-токоферола ацетатом. Чуть менее выраженный синергидный эффект наблюдали при совместном применении интерферона альфа-2b и аскорбиновой кислоты, наименее выраженный синергизм наблюдали для комбинации интерферона альфа-2b и Мексидола.
Выводы
Интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный является эффективным препаратом в отношении вируса гриппа птиц A/Anhui/2013 (H7N9), значение химиотерапевтического индекса препарата равно 16. Применение интерферона альфа-2b в комбинации с антиоксидантами повышает его эффективность в отношении вируса гриппа птиц A/Anhui/2013 (H7N9) в 8 раз, до величины химиотерапевтического индекса 128.
Загрузка …
