Малиновская В.В.1, Дмитриева Е.В.1, Паршина О.В.1, Гусева Т.С.1,
Новикова С.В.2, Бочарова И.И.2, Гайдерова Л.А.3
1 – Учреждение РАМН Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН, г. Москва;
2 – ГУЗ «Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии» (МОНИИАГ), г. Москва;
3 – ФГУН Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича, г. Москва.
Широкая распространенность среди населения урогенитальных инфекций (УГИ) как вирусной (цитомегаловирус, вирус простого герпеса), так и бактериальной (микоплазма, уреаплазма) природы обуславливает необходимость их своевременной диагностики и лечения. Беременность сопровождается физиологическим иммунодефицитом, что представляет опасность с точки зрения первичного инфицирования или активации хронической инфекции у беременных. Состояние иммунной системы беременной женщины определяет состояние иммунитета плода [4, 8]. У беременных с УГИ увеличен риск внутриутробного или перинатального инфицирования, поскольку иммунная система плода и новорожденного характеризуется незрелостью и повышенной восприимчивостью к инфекциям [3, 5, 9]. Для профилактики внутриутробного инфицирования уже более 10 лет в качестве иммунокорректора в акушерско-гинекологической практике применяется препарат рекомбинантного интерферона альфа-2 Виферон-суппозитории ректальные [6]. В ходе многочисленных исследований была показана высокая клиническая эффективность применения Виферона в комплексной терапии беременных с УГИ, которая заключалась как в снижении частоты осложнений беременности, родов и послеродового периода, так и в снижении доли перинатальных осложнений [10]. При этом было подробно охарактеризовано влияние виферонотерапии беременных с УГИ на состояние специфического иммунитета новорожденных [1, 2], в то время как состоянию неспецифического звена иммунитета новорожденных до недавнего времени уделялось недостаточно внимания.
Вместе с тем для элиминации вирусной или бактериальной инфекции организму необходимо хорошо координированное взаимодействие систем врожденного и приобретенного иммунитета. Основная задача системы врожденного иммунитета – обнаружение инфекционного агента с помощью патоген-распознающих рецепторов: распознаются специфические консервативные структуры, экспрессируемые широким спектром микрооганизмов, как например, липополисахарид (ЛПС) – основной компонент клеточной стенки грамотрицательных бактерий [11]. Все больше свидетельств говорит в пользу того, что центральными патоген-распознающими рецепторами системы врожденного иммунитета являются рецепторы семейства TLR. Характерный для моноцитов/макрофагов поверхностный антиген CD14 также функционирует как патоген-распознающий рецептор, однако, ввиду отсутствия трансмембранного и цитоплазматического доменов, при передаче сигнала он нуждается в корецепторах: их роль выполняют TLR-2 и TLR-4 [14]. Есть данные, указывающие на то, что микробные компоненты в первую очередь взаимодействуют с CD14, а затем с рецепторами TLR [15]. На сегодняшний день у млекопитающих охарактеризовано 13 членов семейства Toll-подобных рецепторов, названных из-за гомологии с противомикробными Toll-белками плодовой мушки [12]. Они представляют собой трансмембранные рецепторы, состоящие из внеклеточного домена и цитоплазматического TIR-домена, при связывании которого с цитозольным белком MyD88 в результате сложного каскада межбелковых взаимодействий происходит активация ядерного транскрипционного фактора NF-?B. NF-?B представляет собой активатор транскрипции ряда провоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-1?, ИЛ-6, ФНО-?, ИЛ-12, хемокинов, а также индуцирует экспрессию антигенпрезентирующими клетками костимулирующих молекул, в частности CD80, CD86 и CD40, наличие которых необходимо для активации Т-лимфоцитов при представлении антигена главным комплексом гистосовместимости (ГКГ) II класса [13]. Таким образом, экспрессируемые макрофагами рецепторы семейства TLR способствуют вовлечению в процесс элиминации инфекции приобретенного звена иммунитета. Не случайно в настоящем исследовании, оценивая состояние неспецифического иммунитета у новорожденных от матерей с УГИ, наряду с определением в пуповинной крови количества и степени цитотоксичности натуральных киллеров, мы большое внимание уделили изучению фенотипических и функциональных особенностей моноцитов, в частности, оценивали степень экспрессии на поверхности моноцитов патоген-распознающих рецепторов CD14, TLR-2 и TLR-4, а также молекулы HLA-DR, которая является частью ГКГ II класса, и оценивали способность моноцитов секретировать провоспалительные цитокины ИЛ-1?, ИЛ-6 и ФНО-? in vitro.
Материалы и методы. Исследование проводилось на базе ГУЗ МОНИИАГ (директор – член-кор. РАМН, проф. Краснопольский В.И.). Объем наблюдений составили 33 новорожденных со сроком гестации при рождении 37 – 41 неделя. В первую группу были включены 14 новорожденных от женщин со смешанными УГИ, не получавших Виферон в комплексе дородовой подготовки. Вторую группу составили 14 новорожденных от женщин со смешанными УГИ, получавших в комплексе дородовой подготовки виферонотерапию, начиная со второго триместра беременности, согласно утвержденной схеме [7]. На проведение обследования и применение Виферона было получено информированное согласие беременных. Контрольная группа представлена 5 новорожденными от здоровых женщин без клинико-лабораторных признаков УГИ.
Для иммунофенотипического исследования лейкоцитов использовалась цельная кровь из пуповинной вены новорожденных, собранная в пробирки с К3ЭДТА. На двухлазерном проточном цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с использованием 4-х-цветной панели антител MultiTEST IMK Kit (Becton Dickinson) исследовали основные субпопуляции лимфоцитов. Оценку степени экспрессии поверхностных маркеров TLR-2, TLR-4 и молекулы HLA-DR на моноцитах проводили с использованием мышиных моноклональных антител к человеческим антигенам производства фирмы Becton Dickinson анти-CD14-PerCP, анти-HLА-DR-APC и фирмы eBioscience к антигенам TLR-2-FITC (CD282), TLR-4-PE (CD284) в количествах и согласно методикам, рекомендуемым производителями. Гейтирование популяции моноцитов проводили на основании экспрессии CD14 и бокового светорассеяния (SSC). Для оценки степени экспрессии исследуемых маркеров использовали разницу интенсивности флуоресценции клеток MFI (mean fluorescence intensity) при связывании со специфическими моноклональными антителами и изотипическим контролем.
Функциональную активность моноцитов цельной крови оценивали по продукции ими цитокинов in vitro под действием раствора пирогенала (ЛПС, выделенный из клеток Salmonella typhi, производства фирмы «МЕДГАМАЛ» НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН). Для этого пуповинную кровь собирали в пробирки с гепарином натрия, разводили питательной средой 1:5, добавляли пирогенал в концентрации 1 мкг/мл и инкубировали при 37° С в течение 24 часов. По окончании инкубации клетки крови осаждали центрифугированием, супернатант отбирали, замораживали и хранили при – 25° С до постановки иммуноферментного анализа для определения уровня ИЛ-1?, ИЛ-6, ФНО-?. Для анализа использовали тест-системы производства «Вектор-Бест» с порогом чувствительности 5 пкг/мл.
Статистическую обработку полученных данных проводили на программном обеспечении SPSS 16.0 для Windows. Значимость различий полученных средних значений данных иммунофенотипирования лейкоцитов между выборками оценивали с помощью метода one-way ANOVA. Различия в медианах уровней цитокинов оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Отличия средних считали достоверными при рРезультаты исследования. В таблицах 1 и 2 представлены результаты статистической обработки полученных данных. У обеих групп новорожденных от матерей с УГИ значимо снижено процентное содержание среди всех лимфоцитов натуральных киллеров с фенотипом CD3-CD16+CD56+ по сравнению с группой здоровых новорожденных (табл. 1). То же касается доли натуральных киллеров с высоким цитотоксическим потенциалом, характеризующихся фенотипом CD3-CD8+. По этим двум показателям не было выявлено различий между 1 и 2 группами новорожденных. Дефицит натуральных киллеров свидетельствует о низкой резистентности иммунной системы новорожденного к инфекции, в первую очередь вирусной.
При анализе фенотипа моноцитов пуповинной крови новорожденных открывается иная картина: несмотря на небольшую выборку удалось найти достоверные различия в показателях между 1 группой и контрольной группой здоровых детей, а также между новорожденными 1 и 2 групп (табл. 1). В то же время аналогичные показатели у новорожденных 2 группы были близки к таковым в контрольной группе и достоверно не отличались от них. У детей 1 группы значимо снижена экспрессия CD14 и TLR-2. По TLR-4 значимых отличий между группами получено не было, что, возможно, связано с низким уровнем экспрессии этого рецептора моноцитами человеческой крови. Интересно, что наряду с пониженным уровнем экспрессии патоген-распознающих рецепторов CD14 и TLR-2, моноциты пуповинной крови детей 1 группы экспрессируют достоверно более высокий уровень молекулы ГКГ II класса HLA-DR, что свидетельствует об активированном состоянии этих клеток.
Интересно, что обнаруженные отличия в фенотипе моноцитов новорожденных 1 и 2 групп нашли подтверждение в функциональном тесте. При изучении цитокин-продуцирующей способности моноцитов пуповинной крови in vitro в стандартных условиях между 1 и 2 группами детей была найдена статистически значимая разница в уровнях продукции интерлейкина-1? (р=0,003), интерлейкина-6 (р=0,036), фактора некроза опухоли-? (р=0,059) (табл 2). Эти три цитокина являются «монокинами», продуцируются моноцитами в ответ на активирующее воздействие, и, как следует из современных представлений, в ответ на активацию Toll-подобных рецепторов. Дополнительным свидетельством в пользу такого представления послужили обнаруженные нами линейные зависимости между степенью экспрессии TLR-2 на моноцитах и уровнем индуцированной продукции интерлейкина-1 (коэффициент корреляции r=0,76) и интерлейкина-6 (r=0,47). Тот факт, что моноциты пуповинной крови детей 1 группы продуцируют существенно меньшие количества провоспалительных цитокинов в ответ на стимулирующее действие по сравнению со 2 группой детей, может быть следствием установленного нами значительно более низкого уровня экспрессии патоген-распознающих рецепторов на поверхности моноцитов пуповинной крови детей из 1 группы.
Выводы. Многолетний опыт клинического применения Виферона в акушерско-гинекологической практике доказал его несомненную клиническую эффективность и выявил положительное влияние на ряд лабораторных показателей адаптивного иммунитета. Мы в своем исследовании обнаружили еще и влияние Виферона на показатели врожденного иммунитета. Виферон выступает в качестве антенатального иммунокорректора, он выравнивает показатели врожденного иммунитета до нормальных значений. Значимость врожденного звена иммунитета трудно переоценить, особенно у новорожденных, у которых система адаптивного иммунитета отличается функциональной незрелостью. Клетки врожденного иммунитета отвечают за распознавание патогена и восприимчивость к инфекциям. Следствием снижения уровня экспрессии на моноцитах рецепторов, распознающих патоген, может стать отсутствие адекватной реакции на проникновение чужеродных агентов (микроорганизмов), персистенция инфекции и хронизация процесса, поскольку, как следует из результатов нашего исследования, экспрессия поверхностных антигенов на моноцитах коррелирует с функциональной активностью этих клеток. У беременных женщин с УГИ рождаются дети со сниженным уровнем экспрессии патоген-распознающих рецепторов CD14, TLR-2 и увеличенным уровнем экспрессии HLA-DR на моноцитах. Такие моноциты хуже воспринимают новый инфекционный материал, не способны к адекватной активации – восприятию и передаче сигнала об инфекте, продукция провоспалительных цитокинов в этих клетках подавлена, что отразится на своевременном вовлечении в иммунный ответ адаптивного звена иммунитета. Такое «беззащитное» состояние иммунитета перед инфекцией не только само по себе опасно для новорожденных, но и подвергает сомнению перспективу развития адекватной реакции на вакцинопрофилактику, поскольку ряд профилактических прививок новорожденным делают в первые часы и дни жизни. В то же время у женщин с УГИ, получавших во время беременности в комплексе дородовой терапии Виферон, рождаются дети с фенотипическими и функциональными показателями врожденного иммунитета, близкими к таковым у новорожденных от здоровых неинфицированных женщин. В этой связи назначение курса Виферона беременным с УГИ, помимо несомненного положительного клинического эффекта на течение беременности и перинатальный исход, может служить необходимой «страховкой», снижающей риск ВУИ и антенатального инфицирования, а также обеспечивающей адекватный ответ на вакцинопрофилактику.
Загрузка …
