Российский аллергологическтй журнал No6/2008 ( с.74-81)
Малиновская В.В., Гусева Т.С., Паршина О.В., *Гаджиева З.С., *Павлова М.В.,* Климова Р.Р.,* Адиева А.А., ** Володин Н.Н., **Гетия Е.Г., **Солдатова И.Г., **Дегтярева М.В., *Кущ А.А.
ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН,
*ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН,
**кафедра неонатологии ФУВ РГМУ, Москва
Введение
Иммунная система новорожденных детей по сравнению со взрослыми характеризуется функциональными особенностями, которые проявляются в сниженном пролиферативном ответе Т-клеток, в низкой активности NK-клеток, в недостаточной регуляции продукции цитокинов и смещении ответа в сторону Тh2-типа [1]. Онтогенетически обусловленные показатели иммунитета увеличивают риск развития инфекционных заболеваний у новорожденных детей. Особого внимания заслуживают недоношенные новорожденные дети (гестационный возраст меньше 37 недель) с низкой массой тела при рождении. Так, установлено, что риск смертельных исходов у недоношенных новорожденных детей, инфицированных вирусом простого герпеса (ВПГ), в 3,7 раз выше, чем у доношенных новорожденных с ВПГ [2]. Исход внутриутробной инфекции (ВУИ) в значительной степени определяется врожденным иммунитетом, который у недоношенных новорожденных детей в настоящее время остается недостаточно изученным. Для оценки особенностей врожденного иммунитета у недоношенных новорожденных детей в настоящей работе проведено изучение интерферонового статуса у детей с клиническими признаками внутриутробной инфекции. Особое внимание уделено инфекциям, вызванным вирусом простого герпеса (ВПГ) и цитомегаловирусом человека (ЦМВ), заболеваемость которыми не только не снижается, но продолжает расти. Так, по официальным данным Роспотребнадзора, за 2006-2007 г.г. количество детей до года, заболевших цитомегаловирусной инфекцией, увеличилось в 1,46 раз [3,4].
Одним из перспективных современных подходов к лечению внутриутробных инфекций является иммунотерапия. В качестве иммуномодулирующего препарата хорошо зарекомендовал себя Виферон – рекомбинантный интерферон-?2b, который успешно применяется для лечения широкого круга инфекционных заболеваний [5] и официально разрешен к применению в неонатологии.
Цель настоящей работы состояла в сравнительном изучении интерферонового статуса у практически здоровых новорожденных детей и у недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками ВУИ и без таковых, а также в оценке влияния лечения препаратом Виферон на интерфероновый статус недоношенных новорожденных детей.
Материалы и методы исследования
Пациенты
Обследовали 131 новорожденного ребенка, родившегося в родильном доме ГБ No8 Департамента здравоохранения г. Москвы (главный врач – А.Б. Дуленков) в период с ноября 2006 года по март 2008 года. Основную группу (группа 1) составили недоношенные новорожденные дети (n=81), гестационный возраст от 25 до 36 недель (в среднем — 27,4±8,6 недель) с клиническими признаками ВУИ, по тяжести состояния переведенные сразу после рождения в отделение реанимации и интенсивной терапии. Основными патологическими состояниями у детей 1-ой группы были пневмония, омфалит, энтероколит, менингоэнцефалит. В группу сравнения (группа 2) были включены недоношенные новорожденные дети без клинических признаков ВУИ (n=18), гестационный возраст от 32 до 37 недель, в среднем – 34,7±1,2 недель. Контрольную группу (группа 3) составили здоровые доношенные новорожденные дети без признаков ВУИ (n=32), гестационный возраст 38-41 недель, в среднем – 38,9±0,8 недель.
Клинические материалы
Основными объектами исследования служили периферическая кровь и моча, по показаниям – ликвор. Для изучения интерферонового статуса образцы крови транспортировали в лабораторию онтогенеза и коррекции системы интерферона ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН (рук. лаб.– профессор, д.б.н. Малиновская В.В.). Для анализа маркеров ВПГ и ЦМВ образцы крови, мочи и ликвора транспортировали в лабораторию клеточной инженерии ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (рук. лаб. – профессор, д.б.н. Кущ А.А.).
Интерфероновый статус
Для оценки интерферонового статуса проводили количественный анализ циркулирующих IFN-? и IFN-? в сыворотках крови пациентов, а также спонтанную (базисную) и индуцированную продукцию данных цитокинов лейкоцитами периферической крови in vitro методом иммуноферментного анализа (ИФА).
Использовали тест-системы ProCon IF2plus (С.-Петербург) и Biosource IFN? (Бельгия) в соответствии с инструкциями фирм-производителей и ридер Anthos 2020.
Предварительно отобрав плазму, периферическую кровь, собранную в пробирки, содержавшие 25 ед/мл гепарина, разводили в 10 раз средой культивирования (RPMI 1640, 5% сыворотки эмбрионов коровы, гентамицин) и инкубировали 18-20 ч при 37°С в атмосфере 5% СО2. Затем пробы культуральной жидкости отбирали, аликвотировали и хранили при -20°С до исследования. В качестве индукторов использовали: для IFN-? – вирус болезни Ньюкасла (ВБН), для IFN-? – ФГА. Чувствительность тест-систем для иммуноферментного определения IFN-? составляла 5 пкг/мл, для определения IFN-? – 3 пкг/мл.
Лечение
Все недоношенные новорожденные дети с ВУИ получали базовую терапию. 19 детям дополнительно к базовой терапии вводили препарат Виферон ректально по 1 свече, содержащей 150000 МЕ, каждые 12 часов в течение 5 дней. Полимеразная цепная реакция ДНК ВПГ и ЦМВ определяли с помощью сертифицированных коммерческих наборов ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. Выделение вирусной ДНК ВПГ и ЦМВ производили с помощью наборов «ДНК-сорб-А-М» и «ДНК-сорб-В». Для ПЦР- амплификации использовали комплект реагентов «АмплиСенс ЦМВ» для обнаружения ДНК ЦМВ и «АмплиСенс HSV 1,2 типов» для выявления ДНК ВПГ. Амплификация проводилась с использованием термоциклера «Терцик» («ДНК-Технология», Россия) согласно рекомендации производителя тест-систем.
Быстрый культуральный метод
БКМ выполняли в соответствии с Методическими рекомендациями, утвержденными Роспотребнадзором [6]. Для выявления ВПГ в культуру клеток Vero вносили клинический материал от детей и инкубировали в течение 1 ч при температуре 37oС в атмосфере 5% СО2. Через 24 ч проводили детекцию ВПГ с помощью моноклональных антител (МКА) в реакции непрямой иммунофлюоресценции [7]. Чувствительность БКМ соответствовала активности 5 вирусных частиц в 1 мл [8]. Для 4 выявления ЦМВ использовали диплоидные фибробласты эмбриона человека (ФЭЧ). Процедуры внесения материалов от пациентов, их сокультивирование с клетками ФЭЧ осуществляли так же, как описано выше. Для обнаружения белков ЦМВ использовали МКА к ЦМВ [9].
Статистическая обработка
Для статистической обработки результатов использовали пакет прикладных компьютерных программ STATISTICA 6,0 и BIOSTAT. Применение критерия Шапиро- Уилка показало отсутствие нормального распределения признаков при количественной оценке уровней IFNs . Для сравнения непараметрических данных использовали критерий Манна-Уитни, для парных сравнений – критерий Вилкоксона. Частоту встречаемости маркеров ВПГ и ЦМВ анализировали с помощью двухстороннего точного критерия Фишера. Различия показателей считали статистически значимыми при р Результаты исследования
Первая часть работы была посвящена сравнительному изучению интерферонового статуса у детей, входивших в контрольную (группа 3) и группу сравнения (группа 2). Данные представлены в Таблице 1. Было установлено, что уровни сывороточного IFN-?, а также спонтанной продукции IFN-? в обеих группах не различались и находились на низком уровне. Индуцированная продукция IFN-? была значительно выше в контрольной группе по сравнению с группой сравнения.
Количественная оценка IFN-? показала, что уровни цитокина в сыворотках крови детей групп 2 и 3, а также спонтанная продукция IFN-? в этих группах не различались и находились на пороге чувствительности метода. Индуцированная продукция IFN-? у недоношенных детей в группе 2 оказалась более высокой, чем у доношенных в группе 3: медианы – 34 пкг/мл и 4 пкг/мл, соответственно (р=0,005)
(Таблица 1).
Следующая часть работы состояла в выяснении вопроса о том, какова продукция IFN-? и IFN-? у детей основной группы – недоношенных новорожденных с признаками ВУИ (группа 1) по сравнению с недоношенными детьми без клинических признаков ВУИ (группа 2). Количественный анализ (Таблица 1) показал, что концентрации обоих цитокинов в сыворотках крови, а также спонтанная продукция в культуре лейкоцитов периферической крови in vitro у обследованных детей в группах 1 и 2 находились на пороге чувствительности метода и не различались (р>0,05). Результаты сравнения 5 индуцированной продукции обоих цитокинов выявили статистически значимые различия: у детей 1-ой группы количество IFN-? оказалось существенно выше, (р=0,001), тогда как количество IFN-? – ниже (р=0,03), чем у детей 2-ой группы. Следует отметить, что показатели индуцированной продукции IFN-? у недоношенных новорожденных детей значительно варьировали.
Об этом свидетельствуют данные, представленные в виде гистограмм на рис.1. Они показывают, что распределение показателей цитокина в группе 1 сдвинуто в сторону больших значений: значения, превышающие 50 пкг/мл, в группе 1 встречаются в 45% случаев, тогда как в группе 2 – в 17% случаев. Продукция IFN-? лейкоцитами в ответ на индукцию ФГА в группах 1 и 2 также характеризовалась значительной вариабельностью показателей (рис. 2).
Особый интерес представляло выяснение вопроса о влиянии лечения препаратом Виферон на интерфероновый статус недоношенных новорожденных детей с признаками ВУИ при рождении. Анализ уровней IFN-? и IFN-? до лечения и через 1-2 месяца после лечения Вифероном был проведен у 19 пролеченных детей из группы 1. Было установлено, что количества сывороточного и спонтанного IFN-? были низкими и не различались до и после лечения. В связи с высокой вариабельностью значений индуцированного IFN-? (рис.1) дети данной группы были разделены на 2 подгруппы: в подгруппу 1А (n=8) вошли дети с высоким исходным уровнем (>100 пкг/мл) индуцированной продукции IFN-?, в подгруппу 1Б (n=11) – с низким уровнем (10 пкг/мл, n=10) исходным уровнем индукции цитокина. Оказалось, что у детей с исходно низким уровнем продукции после лечения Вифероном количество индуцированного IFN-? возрастало (медианы 3 пкг/мл и 25 пкг/мл, соответственно, p=0,0001). У детей с исходно высоким уровнем количество индуцированного IFN-? не изменялось, р=0,75. У детей, получавших базовое лечение без Виферона уровень индуцированной продукции IFN-? значительно увеличивался: от 4 пкг/мл до лечения до 46 пкг/мл через 1 месяц после его начала (p=0,0076). Следует отметить, что у всех недоношенных детей с ВУИ через месяц после начала лечения (как базового, так и с применением Виферона) уровень индуцированной продукции IFN-? статистически значимо превышал таковой у здоровых доношенных новорожденных детей (медиана 4 пкг/мл), р=0,0001. ЗДЕСЬ В каждой группе обследованных детей выявляли ВПГ и ЦМВ. Инфекционную активность вирусов определяли методом БКМ, ДНК ВПГ и ЦМВ – методом ПЦР. В контрольной группе 3 ВПГ был обнаружен БКМ и/или ПЦР у 9 из 32 детей (28%), в группе 2 – недоношенных детей без ВУИ – у 7 из 18 (39%). В основной группе 1 у недоношенных детей с ВУИ маркеры ВПГ были выявлены у 41 из 81 (51%) новорожденных детей (Таблица 2). Частота встречаемости маркеров ВПГ в группах 3 и 2 не различалась, в группах 1 и 2 – также не различалась. В то же время частота встречаемости ВПГ в основной группе 1 была выше, чем в контрольной группе 3 (р=0,05). У подавляющего большинства обследованных детей во всех группах количество ВПГ в изученных образцах было низким (соответствовало 5 вирусным частицам в 1 мл клинического материала). ЦМВ в контрольной группе и в группе сравнения (группы 3 и 2) обнаруживался редко: у 2 из 32 (6,25%) и у 1 из 18 (5,5%) детей, соответственно. В основной группе частота выявления маркеров ЦМВ была выше (20/81, 25%) и значимо отличалась от частоты выявления ЦМВ в контрольной группе (р=0,048). Следует отметить, что в группах 2 и 3 (дети без признаков ВУИ) была выявлена только ДНК ЦМВ и не обнаружена инфекционная активность вируса. У большинства детей в основной группе 1 (недоношенные дети с ВУИ) регистрировалась высокая вирусная нагрузка ЦМВ: у 82% детей, имевших маркеры ЦМВ, количество вируса превышало 5 вирусных частиц в 1 мл.
Проведен сравнительный анализ уровней индуцированной продукции IFN-? и IFN-? у детей с маркерами герпесвирусных инфекций и без таковых (Таблица 3). Он показал, что уровни индуцированного IFN-? у детей, не инфицированных ВПГ (ВПГ_), во всех группах не различались. У детей, у которых были выявлены маркеры ВПГ (ВПГ+), различия уровней индуцированной продукции IFN-? оказались статистически значимыми как между 3 и 2 группами (р=0,043), так и между 2 и 1 группами (р=0,001). Это свидетельствует о пониженной способности лейкоцитов недоношенных детей отвечать на вирусную инфекцию, индуцированную ВБН, продукцией IFN-? по сравнению с доношенными новорожденными детьми. Также как и во всей популяции обследованных детей с ВУИ, у ВПГ-инфицированных детей наблюдался повышенный уровень индуцированной продукции IFN-? (Таблицы 1 и 3).
Изучение уровней индуцированной продукции IFN-? выявило различия между лимфоцитами детей, инфицированных и неинфицированных ВПГ и ЦМВ в основной и в контрольной группе (Таблица 3). Интересно, что эти изменения оказались разнонаправленными: в контрольной группе 3 уровень индуцированного IFN-? был достоверно выше у ВПГ-инфицированных детей по сравнению с неинфицированными (р=0,007). В основной группе 1 у детей с маркерами ВПГ уровень IFN-? был достоверно ниже, чем у детей без вирусных маркеров (р=0,05). Сходные результаты были получены при анализе индуцированной продукции IFN-? у детей, инфицированных ЦМВ (Таблица 3). Было установлено, что у детей основной группы, инфицированных ЦМВ, уровни индуцированной продукции IFN-? были достоверно снижены по сравнению с неинфицированными детьми (р=0,021). Это означает, что и ВПГ и ЦМВ подавляют способность лейкоцитов к продукции IFN-? у недоношенных новорожденных детей с признаками ВУИ. Напротив, лимфоциты доношенных новорожденных детей без ВУИ способны отвечать продукцией IFN-? на ВПГ- инфекцию.
Представляло интерес выяснить действие Виферона на состояние здоровья недоношенных новорожденных детей с ВУИ. Для изучения этого вопроса группы детей с ВУИ, получавших как базовое лечение без Виферона, так и терапию с Вифероном были расширены до 38 детей и 81 ребенка, соответственно. Оценивали показатели летальности в обеих группах. Анализ показал, что при использовании базовой терапии за время наблюдения умерло 7/38 детей (18,4%), тогда как при базовой терапии с применением Виферона показатель летальности статистически значимо снизился и составил 5% (4/81, р=0,036).
Обсуждение
Изучение IFN-? и IFN-? в сыворотках крови новорожденных детей выявило низкие количества цитокинов во всех группах (Таблица 1). В то же время в настоящей работе показано достоверное и неодинаковое изменение продукции IFN-? и IFN-? клетками периферической крови обследованных новорожденных детей после индукции in vitro (Таблицы 1 и 3). У недоношенных новорожденных детей без ВУИ (группа 2) уровень индуцированного IFN-? был снижен по сравнению с доношенными новорожденными (группа 3). В ряде работ показана дефектность в продукции IFN-? наиболее эффективными продуцентами этого цитокина – плазмацитоидными дендритными клетками (pDC) у новорожденных детей по сравнению со взрослыми людьми [10,11,12]. Можно предположить, что снижение индуцированного IFN-?, выявленное в настоящей работе, является следствием еще более низкой функциональной активности pDC и других клеток-продуцентов IFN-? у недоношенных новорожденных детей по сравнению с доношенными.
Способность к индукции IFN-? клетками недоношенных детей без клинических признаков ВУИ оказалась повышенной по сравнению с доношенными детьми (Таблица
1). Негативная корреляция между гестационным возрастом и индуцированным IFN-? обнаружена и другими исследователями [1]. Можно предположить, что повышенный уровень индуцированного IFN-? у недоношенных детей является следствием предшествовавшей сенсибилизации Т-клеток чужеродными антигенами. Не исключено, что именно высокая активность Т-клеток – продуцентов IFN-? предотвращала проявление клинических признаков ВУИ в данной группе недоношенных новорожденных детей подобно тому, как повышенный уровень индуцированного IFN-? у ВПГ-инфицированных доношенных новорожденных детей контрольной группы (Таблица 3) не позволил развиться герпесвирусной болезни.
Изучение материалов от недоношенных новорожденных детей с признаками ВУИ (группа 1) выявило достоверное увеличение уровня индуцированного IFN-? по сравнению с недоношенными новорожденными детьми без признаков ВУИ (группа 2). Можно предположить, что в этот эффект внесли существенный вклад герпесвирусные инфекции, так как инфицированность детей группы 1 как ВПГ, так и ЦМВ, достоверно превышала таковую в группах 2 и 3. Действительно, среди ВПГ-инфицированных детей c клиническими признаками ВУИ уровень индуцированного IFN-? был достоверно выше, чем среди детей без ВУИ в группе 2. При оценке значимости этого показателя следует иметь в виду, что он является усредненным результатом по всем обследованным детям с ВУИ. В то же время важным фактом, выявленным в ходе настоящей работы, является значительная вариабельность уровней индуцированного IFN-? в группе 1, превышающая таковую в группе 2 (рис. 1). Так, в группе 1 значительная доля показателей превышала уровень 50 пкг/мл и даже 100 пкг/мл, которые можно рассматривать для недоношенных детей как результат избыточной активации Т-лимфоцитов. Известно, что чрезмерная продукция провоспалительных цитокинов может приводить к вредным последствиям (аутоиммунные и другие заболевания, повреждение и гибель иммунных клеток). С другой стороны, пониженная продукция IFN-? увеличивает чувствительность к вирусным инфекциям [13]. Большой разброс показателей может указывать на дисбаланс в регуляции экспрессии IFN-? в лимфоцитах недоношенных новорожденных детей с ВУИ, в том числе герпесвирусной этиологии, о чем свидетельствуют данные рис.1 и Таблицы 3.
Полученные данные показали достоверное подавление способности отвечать на индуцирующий стимул продукцией IFN-? у клеток недоношенных новорожденных детей с ВУИ под действием герпесвирусов (Таблица 3). Сходные данные получены при обследовании ЦМВ-инфицированных новорожденных детей [14]. Подавление способности продуцировать IFN-? в ответ на стимуляцию ЦМВ и ВПГ-1 было показано при изучении pDC пуповинной крови по сравнению с клетками взрослых лиц [10]. Данные опубликованных работ в отношении IFN-? противоречивы. Увеличение уровня IFN-? у недоношенных новорожденных детей (27,1 недели гестации) в первые дни жизни ассоциировалось с повреждением мозга [15]. Значительное увеличение провоспалительных цитокинов, включая IFN-?, было зарегистрировано при обследовании инфицированных недоношенных новорожденных детей по сравнению с неинфицированными [16]. В другой работе [17] сообщали, что у недоношенных новорожденных детей продукция IFN-? после индукции была заметно снижена по сравнению со взрослыми людьми и доношенным новорожденными детьми, но вследствие инфицирования – возрастала. Наконец, продукция IFN-? вообще не была выявлена в стимулированных ФГА клетках из пупочного канальца от здоровых новорожденных (как доношенных, так и недоношенных), но была обнаружена в стимулированных клетках от взрослых доноров [18]. Расхождения данных можно объяснить различиями различной в тяжестью иммунных инфекционного реакциях между процесса, детьми внутри индивидуальными каждой группы, неодинаковым ответом на разные вирусы [19], относительно малыми выборками.
Выявленный нами большой разброс данных при количественном анализе 10 индуцированного IFN-? (рис.2) подтверждает это заключение.
Дальнейшие исследования позволят получить более полные сведения о функционировании системы интерферона у недоношенных новорожденных детей, в том числе и особенно – у внутриутробно инфицированных.
Обнаруженная в настоящей работе низкая способность к индукции IFN-? у недоношенных новорожденных по сравнению с доношенными, а также нарушение регуляции иммунных реакций у внутриутробно инфицированных недоношенных новорожденных детей указывают на целесообразность применения иммуномодулирующей терапии для лечения преждевременно родившихся детей с клиническими признаками внутриутробных инфекций.
Введение Виферона в виде свечей, содержащих относительно низкие количества рекомбинантного IFN-?2, привело к иммуномодулирующему эффекту.
Иммунокоррекция проявилась в повышении уровней индуцированных IFN-? и IFN-? у детей с исходно низкой способностью к индукции данных цитокинов, в снижении количества индуцированного IFN-? у детей с исходно повышенной активацией Т- клеток до контрольного уровня доношенных детей. Наиболее важным показателем действия Виферона явилось статистически значимое снижение смертности у недоношенных детей с ВУИ по сравнению с детьми из этой группы, получавших базовое лечение без Виферона (4% против 18%).
Можно предположить, что IFN-? в составе Виферона при ректальном введении воздействует на лимфоидные клетки слизистой кишечного тракта, запуская каскад событий, ведущих к транскрипционной индукции интерферон-стимулируемых генов, продукты которых выполняют иммуномодулирующие функции.
