Российский аллергологическтй журнал No6/2008 ( с.74-81)
Малиновская В.В., Гусева Т.С., Паршина О.В., *Гаджиева З.С., *Павлова М.В.,* Климова Р.Р.,* Адиева А.А., ** Володин Н.Н., **Гетия Е.Г., **Солдатова И.Г., **Дегтярева М.В., *Кущ А.А.
ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН,
*ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН,
**кафедра неонатологии ФУВ РГМУ, Москва
Введение
Иммунная система новорожденных детей по сравнению со взрослыми характеризуется функциональными особенностями, которые проявляются в сниженном пролиферативном ответе Т-клеток, в низкой активности NK-клеток, в недостаточной регуляции продукции цитокинов и смещении ответа в сторону Тh2-типа [1]. Онтогенетически обусловленные показатели иммунитета увеличивают риск развития инфекционных заболеваний у новорожденных детей. Особого внимания заслуживают недоношенные новорожденные дети (гестационный возраст меньше 37 недель) с низкой массой тела при рождении. Так, установлено, что риск смертельных исходов у недоношенных новорожденных детей, инфицированных вирусом простого герпеса (ВПГ), в 3,7 раз выше, чем у доношенных новорожденных с ВПГ [2]. Исход внутриутробной инфекции (ВУИ) в значительной степени определяется врожденным иммунитетом, который у недоношенных новорожденных детей в настоящее время остается недостаточно изученным. Для оценки особенностей врожденного иммунитета у недоношенных новорожденных детей в настоящей работе проведено изучение интерферонового статуса у детей с клиническими признаками внутриутробной инфекции. Особое внимание уделено инфекциям, вызванным вирусом простого герпеса (ВПГ) и цитомегаловирусом человека (ЦМВ), заболеваемость которыми не только не снижается, но продолжает расти. Так, по официальным данным Роспотребнадзора, за 2006-2007 г.г. количество детей до года, заболевших цитомегаловирусной инфекцией, увеличилось в 1,46 раз [3,4].
Одним из перспективных современных подходов к лечению внутриутробных инфекций является иммунотерапия. В качестве иммуномодулирующего препарата хорошо зарекомендовал себя Виферон – рекомбинантный интерферон-?2b, который успешно применяется для лечения широкого круга инфекционных заболеваний [5] и официально разрешен к применению в неонатологии.
Цель настоящей работы состояла в сравнительном изучении интерферонового статуса у практически здоровых новорожденных детей и у недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками ВУИ и без таковых, а также в оценке влияния лечения препаратом Виферон на интерфероновый статус недоношенных новорожденных детей.
Материалы и методы исследования
Пациенты
Обследовали 131 новорожденного ребенка, родившегося в родильном доме ГБ No8 Департамента здравоохранения г. Москвы (главный врач – А.Б. Дуленков) в период с ноября 2006 года по март 2008 года. Основную группу (группа 1) составили недоношенные новорожденные дети (n=81), гестационный возраст от 25 до 36 недель (в среднем – 27,4±8,6 недель) с клиническими признаками ВУИ, по тяжести состояния переведенные сразу после рождения в отделение реанимации и интенсивной терапии. Основными патологическими состояниями у детей 1-ой группы были пневмония, омфалит, энтероколит, менингоэнцефалит. В группу сравнения (группа 2) были включены недоношенные новорожденные дети без клинических признаков ВУИ (n=18), гестационный возраст от 32 до 37 недель, в среднем – 34,7±1,2 недель. Контрольную группу (группа 3) составили здоровые доношенные новорожденные дети без признаков ВУИ (n=32), гестационный возраст 38-41 недель, в среднем – 38,9±0,8 недель.
Клинические материалы
Основными объектами исследования служили периферическая кровь и моча, по показаниям – ликвор. Для изучения интерферонового статуса образцы крови транспортировали в лабораторию онтогенеза и коррекции системы интерферона ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН (рук. лаб.– профессор, д.б.н. Малиновская В.В.). Для анализа маркеров ВПГ и ЦМВ образцы крови, мочи и ликвора транспортировали в лабораторию клеточной инженерии ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (рук. лаб. – профессор, д.б.н. Кущ А.А.).
Интерфероновый статус
Для оценки интерферонового статуса проводили количественный анализ циркулирующих IFN-? и IFN-? в сыворотках крови пациентов, а также спонтанную (базисную) и индуцированную продукцию данных цитокинов лейкоцитами периферической крови in vitro методом иммуноферментного анализа (ИФА).
Использовали тест-системы ProCon IF2plus (С.-Петербург) и Biosource IFN? (Бельгия) в соответствии с инструкциями фирм-производителей и ридер Anthos 2020.
Предварительно отобрав плазму, периферическую кровь, собранную в пробирки, содержавшие 25 ед/мл гепарина, разводили в 10 раз средой культивирования (RPMI 1640, 5% сыворотки эмбрионов коровы, гентамицин) и инкубировали 18-20 ч при 37°С в атмосфере 5% СО2. Затем пробы культуральной жидкости отбирали, аликвотировали и хранили при -20°С до исследования. В качестве индукторов использовали: для IFN-? – вирус болезни Ньюкасла (ВБН), для IFN-? – ФГА. Чувствительность тест-систем для иммуноферментного определения IFN-? составляла 5 пкг/мл, для определения IFN-? – 3 пкг/мл.
Лечение
Все недоношенные новорожденные дети с ВУИ получали базовую терапию. 19 детям дополнительно к базовой терапии вводили препарат Виферон ректально по 1 свече, содержащей 150000 МЕ, каждые 12 часов в течение 5 дней. Полимеразная цепная реакция ДНК ВПГ и ЦМВ определяли с помощью сертифицированных коммерческих наборов ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. Выделение вирусной ДНК ВПГ и ЦМВ производили с помощью наборов «ДНК-сорб-А-М» и «ДНК-сорб-В». Для ПЦР- амплификации использовали комплект реагентов «АмплиСенс ЦМВ» для обнаружения ДНК ЦМВ и «АмплиСенс HSV 1,2 типов» для выявления ДНК ВПГ. Амплификация проводилась с использованием термоциклера «Терцик» («ДНК-Технология», Россия) согласно рекомендации производителя тест-систем.
Быстрый культуральный метод
БКМ выполняли в соответствии с Методическими рекомендациями, утвержденными Роспотребнадзором [6]. Для выявления ВПГ в культуру клеток Vero вносили клинический материал от детей и инкубировали в течение 1 ч при температуре 37oС в атмосфере 5% СО2. Через 24 ч проводили детекцию ВПГ с помощью моноклональных антител (МКА) в реакции непрямой иммунофлюоресценции [7]. Чувствительность БКМ соответствовала активности 5 вирусных частиц в 1 мл [8]. Для 4 выявления ЦМВ использовали диплоидные фибробласты эмбриона человека (ФЭЧ). Процедуры внесения материалов от пациентов, их сокультивирование с клетками ФЭЧ осуществляли так же, как описано выше. Для обнаружения белков ЦМВ использовали МКА к ЦМВ [9].
Статистическая обработка
Для статистической обработки результатов использовали пакет прикладных компьютерных программ STATISTICA 6,0 и BIOSTAT. Применение критерия Шапиро- Уилка показало отсутствие нормального распределения признаков при количественной оценке уровней IFNs . Для сравнения непараметрических данных использовали критерий Манна-Уитни, для парных сравнений – критерий Вилкоксона. Частоту встречаемости маркеров ВПГ и ЦМВ анализировали с помощью двухстороннего точного критерия Фишера. Различия показателей считали статистически значимыми при р<0,05.
Результаты исследования
Первая часть работы была посвящена сравнительному изучению интерферонового статуса у детей, входивших в контрольную (группа 3) и группу сравнения (группа 2). Данные представлены в Таблице 1. Было установлено, что уровни сывороточного IFN-?, а также спонтанной продукции IFN-? в обеих группах не различались и находились на низком уровне. Индуцированная продукция IFN-? была значительно выше в контрольной группе по сравнению с группой сравнения.
Количественная оценка IFN-? показала, что уровни цитокина в сыворотках крови детей групп 2 и 3, а также спонтанная продукция IFN-? в этих группах не различались и находились на пороге чувствительности метода. Индуцированная продукция IFN-? у недоношенных детей в группе 2 оказалась более высокой, чем у доношенных в группе 3: медианы – 34 пкг/мл и 4 пкг/мл, соответственно (р=0,005)
(Таблица 1).
Следующая часть работы состояла в выяснении вопроса о том, какова продукция IFN-? и IFN-? у детей основной группы – недоношенных новорожденных с признаками ВУИ (группа 1) по сравнению с недоношенными детьми без клинических признаков ВУИ (группа 2). Количественный анализ (Таблица 1) показал, что концентрации обоих цитокинов в сыворотках крови, а также спонтанная продукция в культуре лейкоцитов периферической крови in vitro у обследованных детей в группах 1 и 2 находились на пороге чувствительности метода и не различались (р>0,05). Результаты сравнения 5 индуцированной продукции обоих цитокинов выявили статистически значимые различия: у детей 1-ой группы количество IFN-? оказалось существенно выше, (р=0,001), тогда как количество IFN-? – ниже (р=0,03), чем у детей 2-ой группы. Следует отметить, что показатели индуцированной продукции IFN-? у недоношенных новорожденных детей значительно варьировали.
Об этом свидетельствуют данные, представленные в виде гистограмм на рис.1. Они показывают, что распределение показателей цитокина в группе 1 сдвинуто в сторону больших значений: значения, превышающие 50 пкг/мл, в группе 1 встречаются в 45% случаев, тогда как в группе 2 – в 17% случаев. Продукция IFN-? лейкоцитами в ответ на индукцию ФГА в группах 1 и 2 также характеризовалась значительной вариабельностью показателей (рис. 2).
Особый интерес представляло выяснение вопроса о влиянии лечения препаратом Виферон на интерфероновый статус недоношенных новорожденных детей с признаками ВУИ при рождении. Анализ уровней IFN-? и IFN-? до лечения и через 1-2 месяца после лечения Вифероном был проведен у 19 пролеченных детей из группы 1. Было установлено, что количества сывороточного и спонтанного IFN-? были низкими и не различались до и после лечения. В связи с высокой вариабельностью значений индуцированного IFN-? (рис.1) дети данной группы были разделены на 2 подгруппы: в подгруппу 1А (n=8) вошли дети с высоким исходным уровнем (>100 пкг/мл) индуцированной продукции IFN-?, в подгруппу 1Б (n=11) – с низким уровнем (<100 пкгмл) цитокина до лечения. Количественный анализ ifn-? показал (рис.3), что в подгруппе 1А результате базового лечения с применением Виферона уровень снижался 4 раза (медианы: 165 мл – и 40после лечения, p =0,01). В 1Б, напротив, выявленоувеличение уровня индуцированного ifn- ?: медианы 15 93 Это свидетельствует об иммуномодулирующем действии Виферона. Оно проявилось разнонаправленном измененииуровней индуцированной продукции лейкоцитами недоношенных детей изобеих подгрупп основной группы. Важно отметить, Вифероном подгруппах статистически значимо не различался (медианы мл, отличался от данного показателя контрольной группе доношенных (медиана 54 р =0,93) (рис. 3). 10 группы 1, которые были обследованы динамике без применения Виферона, составили подгруппу 1В. показатели изменялись вне зависимости исходных (рис.3). Уровень значительноварьировал у 1 (рис.2).связи этим анализировали изменения низким (<10 n =9) относительно высоким (>10 пкг/мл, n=10) исходным уровнем индукции цитокина. Оказалось, что у детей с исходно низким уровнем продукции после лечения Вифероном количество индуцированного IFN-? возрастало (медианы 3 пкг/мл и 25 пкг/мл, соответственно, p=0,0001). У детей с исходно высоким уровнем количество индуцированного IFN-? не изменялось, р=0,75. У детей, получавших базовое лечение без Виферона уровень индуцированной продукции IFN-? значительно увеличивался: от 4 пкг/мл до лечения до 46 пкг/мл через 1 месяц после его начала (p=0,0076). Следует отметить, что у всех недоношенных детей с ВУИ через месяц после начала лечения (как базового, так и с применением Виферона) уровень индуцированной продукции IFN-? статистически значимо превышал таковой у здоровых доношенных новорожденных детей (медиана 4 пкг/мл), р=0,0001. ЗДЕСЬ В каждой группе обследованных детей выявляли ВПГ и ЦМВ. Инфекционную активность вирусов определяли методом БКМ, ДНК ВПГ и ЦМВ – методом ПЦР. В контрольной группе 3 ВПГ был обнаружен БКМ и/или ПЦР у 9 из 32 детей (28%), в группе 2 – недоношенных детей без ВУИ – у 7 из 18 (39%). В основной группе 1 у недоношенных детей с ВУИ маркеры ВПГ были выявлены у 41 из 81 (51%) новорожденных детей (Таблица 2). Частота встречаемости маркеров ВПГ в группах 3 и 2 не различалась, в группах 1 и 2 – также не различалась. В то же время частота встречаемости ВПГ в основной группе 1 была выше, чем в контрольной группе 3 (р=0,05). У подавляющего большинства обследованных детей во всех группах количество ВПГ в изученных образцах было низким (соответствовало 5 вирусным частицам в 1 мл клинического материала). ЦМВ в контрольной группе и в группе сравнения (группы 3 и 2) обнаруживался редко: у 2 из 32 (6,25%) и у 1 из 18 (5,5%) детей, соответственно. В основной группе частота выявления маркеров ЦМВ была выше (20/81, 25%) и значимо отличалась от частоты выявления ЦМВ в контрольной группе (р=0,048). Следует отметить, что в группах 2 и 3 (дети без признаков ВУИ) была выявлена только ДНК ЦМВ и не обнаружена инфекционная активность вируса. У большинства детей в основной группе 1 (недоношенные дети с ВУИ) регистрировалась высокая вирусная нагрузка ЦМВ: у 82% детей, имевших маркеры ЦМВ, количество вируса превышало 5 вирусных частиц в 1 мл.
Проведен сравнительный анализ уровней индуцированной продукции IFN-? и IFN-? у детей с маркерами герпесвирусных инфекций и без таковых (Таблица 3). Он показал, что уровни индуцированного IFN-? у детей, не инфицированных ВПГ (ВПГ_), во всех группах не различались. У детей, у которых были выявлены маркеры ВПГ (ВПГ+), различия уровней индуцированной продукции IFN-? оказались статистически значимыми как между 3 и 2 группами (р=0,043), так и между 2 и 1 группами (р=0,001). Это свидетельствует о пониженной способности лейкоцитов недоношенных детей отвечать на вирусную инфекцию, индуцированную ВБН, продукцией IFN-? по сравнению с доношенными новорожденными детьми. Также как и во всей популяции обследованных детей с ВУИ, у ВПГ-инфицированных детей наблюдался повышенный уровень индуцированной продукции IFN-? (Таблицы 1 и 3).
Изучение уровней индуцированной продукции IFN-? выявило различия между лимфоцитами детей, инфицированных и неинфицированных ВПГ и ЦМВ в основной и в контрольной группе (Таблица 3). Интересно, что эти изменения оказались разнонаправленными: в контрольной группе 3 уровень индуцированного IFN-? был достоверно выше у ВПГ-инфицированных детей по сравнению с неинфицированными (р=0,007). В основной группе 1 у детей с маркерами ВПГ уровень IFN-? был достоверно ниже, чем у детей без вирусных маркеров (р=0,05). Сходные результаты были получены при анализе индуцированной продукции IFN-? у детей, инфицированных ЦМВ (Таблица 3). Было установлено, что у детей основной группы, инфицированных ЦМВ, уровни индуцированной продукции IFN-? были достоверно снижены по сравнению с неинфицированными детьми (р=0,021). Это означает, что и ВПГ и ЦМВ подавляют способность лейкоцитов к продукции IFN-? у недоношенных новорожденных детей с признаками ВУИ. Напротив, лимфоциты доношенных новорожденных детей без ВУИ способны отвечать продукцией IFN-? на ВПГ- инфекцию.
Представляло интерес выяснить действие Виферона на состояние здоровья недоношенных новорожденных детей с ВУИ. Для изучения этого вопроса группы детей с ВУИ, получавших как базовое лечение без Виферона, так и терапию с Вифероном были расширены до 38 детей и 81 ребенка, соответственно. Оценивали показатели летальности в обеих группах. Анализ показал, что при использовании базовой терапии за время наблюдения умерло 7/38 детей (18,4%), тогда как при базовой терапии с применением Виферона показатель летальности статистически значимо снизился и составил 5% (4/81, р=0,036).
Обсуждение
Изучение IFN-? и IFN-? в сыворотках крови новорожденных детей выявило низкие количества цитокинов во всех группах (Таблица 1). В то же время в настоящей работе показано достоверное и неодинаковое изменение продукции IFN-? и IFN-? клетками периферической крови обследованных новорожденных детей после индукции in vitro (Таблицы 1 и 3). У недоношенных новорожденных детей без ВУИ (группа 2) уровень индуцированного IFN-? был снижен по сравнению с доношенными новорожденными (группа 3). В ряде работ показана дефектность в продукции IFN-? наиболее эффективными продуцентами этого цитокина – плазмацитоидными дендритными клетками (pDC) у новорожденных детей по сравнению со взрослыми людьми [10,11,12]. Можно предположить, что снижение индуцированного IFN-?, выявленное в настоящей работе, является следствием еще более низкой функциональной активности pDC и других клеток-продуцентов IFN-? у недоношенных новорожденных детей по сравнению с доношенными.
Способность к индукции IFN-? клетками недоношенных детей без клинических признаков ВУИ оказалась повышенной по сравнению с доношенными детьми (Таблица
1). Негативная корреляция между гестационным возрастом и индуцированным IFN-? обнаружена и другими исследователями [1]. Можно предположить, что повышенный уровень индуцированного IFN-? у недоношенных детей является следствием предшествовавшей сенсибилизации Т-клеток чужеродными антигенами. Не исключено, что именно высокая активность Т-клеток – продуцентов IFN-? предотвращала проявление клинических признаков ВУИ в данной группе недоношенных новорожденных детей подобно тому, как повышенный уровень индуцированного IFN-? у ВПГ-инфицированных доношенных новорожденных детей контрольной группы (Таблица 3) не позволил развиться герпесвирусной болезни.
Изучение материалов от недоношенных новорожденных детей с признаками ВУИ (группа 1) выявило достоверное увеличение уровня индуцированного IFN-? по сравнению с недоношенными новорожденными детьми без признаков ВУИ (группа 2). Можно предположить, что в этот эффект внесли существенный вклад герпесвирусные инфекции, так как инфицированность детей группы 1 как ВПГ, так и ЦМВ, достоверно превышала таковую в группах 2 и 3. Действительно, среди ВПГ-инфицированных детей c клиническими признаками ВУИ уровень индуцированного IFN-? был достоверно выше, чем среди детей без ВУИ в группе 2. При оценке значимости этого показателя следует иметь в виду, что он является усредненным результатом по всем обследованным детям с ВУИ. В то же время важным фактом, выявленным в ходе настоящей работы, является значительная вариабельность уровней индуцированного IFN-? в группе 1, превышающая таковую в группе 2 (рис. 1). Так, в группе 1 значительная доля показателей превышала уровень 50 пкг/мл и даже 100 пкг/мл, которые можно рассматривать для недоношенных детей как результат избыточной активации Т-лимфоцитов. Известно, что чрезмерная продукция провоспалительных цитокинов может приводить к вредным последствиям (аутоиммунные и другие заболевания, повреждение и гибель иммунных клеток). С другой стороны, пониженная продукция IFN-? увеличивает чувствительность к вирусным инфекциям [13]. Большой разброс показателей может указывать на дисбаланс в регуляции экспрессии IFN-? в лимфоцитах недоношенных новорожденных детей с ВУИ, в том числе герпесвирусной этиологии, о чем свидетельствуют данные рис.1 и Таблицы 3.
Полученные данные показали достоверное подавление способности отвечать на индуцирующий стимул продукцией IFN-? у клеток недоношенных новорожденных детей с ВУИ под действием герпесвирусов (Таблица 3). Сходные данные получены при обследовании ЦМВ-инфицированных новорожденных детей [14]. Подавление способности продуцировать IFN-? в ответ на стимуляцию ЦМВ и ВПГ-1 было показано при изучении pDC пуповинной крови по сравнению с клетками взрослых лиц [10]. Данные опубликованных работ в отношении IFN-? противоречивы. Увеличение уровня IFN-? у недоношенных новорожденных детей (27,1 недели гестации) в первые дни жизни ассоциировалось с повреждением мозга [15]. Значительное увеличение провоспалительных цитокинов, включая IFN-?, было зарегистрировано при обследовании инфицированных недоношенных новорожденных детей по сравнению с неинфицированными [16]. В другой работе [17] сообщали, что у недоношенных новорожденных детей продукция IFN-? после индукции была заметно снижена по сравнению со взрослыми людьми и доношенным новорожденными детьми, но вследствие инфицирования – возрастала. Наконец, продукция IFN-? вообще не была выявлена в стимулированных ФГА клетках из пупочного канальца от здоровых новорожденных (как доношенных, так и недоношенных), но была обнаружена в стимулированных клетках от взрослых доноров [18]. Расхождения данных можно объяснить различиями различной в тяжестью иммунных инфекционного реакциях между процесса, детьми внутри индивидуальными каждой группы, неодинаковым ответом на разные вирусы [19], относительно малыми выборками.
Выявленный нами большой разброс данных при количественном анализе 10 индуцированного IFN-? (рис.2) подтверждает это заключение.
Дальнейшие исследования позволят получить более полные сведения о функционировании системы интерферона у недоношенных новорожденных детей, в том числе и особенно – у внутриутробно инфицированных.
Обнаруженная в настоящей работе низкая способность к индукции IFN-? у недоношенных новорожденных по сравнению с доношенными, а также нарушение регуляции иммунных реакций у внутриутробно инфицированных недоношенных новорожденных детей указывают на целесообразность применения иммуномодулирующей терапии для лечения преждевременно родившихся детей с клиническими признаками внутриутробных инфекций.
Введение Виферона в виде свечей, содержащих относительно низкие количества рекомбинантного IFN-?2, привело к иммуномодулирующему эффекту.
Иммунокоррекция проявилась в повышении уровней индуцированных IFN-? и IFN-? у детей с исходно низкой способностью к индукции данных цитокинов, в снижении количества индуцированного IFN-? у детей с исходно повышенной активацией Т- клеток до контрольного уровня доношенных детей. Наиболее важным показателем действия Виферона явилось статистически значимое снижение смертности у недоношенных детей с ВУИ по сравнению с детьми из этой группы, получавших базовое лечение без Виферона (4% против 18%).
Можно предположить, что IFN-? в составе Виферона при ректальном введении воздействует на лимфоидные клетки слизистой кишечного тракта, запуская каскад событий, ведущих к транскрипционной индукции интерферон-стимулируемых генов, продукты которых выполняют иммуномодулирующие функции.
Загрузка …
