Совершенствование диагностики герпесвирусных инфекций

А.Н Васильев, Н.Е. Федорова, Р.Р. Климова, А.А. Адиева.

ФГБУ «НЦЭСМП» Минздравсоцразвития России Центр экспертизы и контроля готовых лекарственных средств.
ФГБУ “НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского” Минздравсоцразвития России, Москва.

Представители семейства герпесвирусов (Herpesviridae) вирус простого герпеса (ВПГ) и цитомегаловирус человека (ЦМВ) чрезвычайно широко распространены в человеческой популяции (1, 2). Данные герпесвирусы (ГВ) вызывают тяжелые нарушения эмбрионального развития вплоть до гибели плода, болезни новорожденных, нейрологические нарушения, глухоту и слепоту, являются причиной тяжелых поражений органов у трансплантационных больных и отторжения пересаженных органов. Оба ГВ способны поражать ЦНС и приводить к энцефалитам со смертельным исходом. Особого внимания заслуживают бессимптомные формы, при которых вирус выделяется из организма и может передаваться как по горизонтали, в том числе половым путем, так и по вертикали – в процессе внутриутробного развития плода. Опасность представляет также отсутствие четких дифференцирующих клинических признаков, нередко наблюдаемое при манифестации инфекций, вызванных ГВ. Проведено сравнение четырех методов выявления ВПГ в соскобах уретры: 1 – иммуноцитохимического метода выявления антигена (АГ) ВПГ в мазках, 2 – быстрого культурального метода (БКМ), 3 – иммуноферментного метода определения АГ ВПГ (ИФА) и 4 – полимеразной цепной реакции (ПЦР). Результаты представлены в Таблице 3. Они показали, что БКМ обнаруживал ВПГ в инфицированных образцах на всех стадиях заболевания, причем на стадии обострения даже в большем количестве, чем ПЦР. Приведенные сведения показывают актуальность усовершенствования лабораторной диагностики ГВИ, которая необходима для надежного установления диагноза, определения формы и стадии заболевания, своевременного начала лечения и мониторинга терапии.

Введение

Представители семейства герпесвирусов (Herpesviridae) вирус простого герпеса (ВПГ) и цитомегаловирус человека (ЦМВ) чрезвычайно широко распространены в человеческой популяции (1, 2). Так, 40%-80% населения в разных регионах мира имеют антитела к ЦМВ и 60-95% – к ВПГ.  Данные герпесвирусы (ГВ) вызывают тяжелые нарушения эмбрионального развития вплоть до гибели плода, болезни новорожденных, нейрологические нарушения, глухоту и слепоту.

Герпесвирусы являются также причиной тяжелых поражений органов у трансплантационных больных и отторжения пересаженных органов. Оба ГВ способны поражать ЦНС и приводить к энцефалитам со смертельным исходом. Герпесвирусы – ВПГ и ЦМВ, относятся к возбудителям заболеваний, передающихся половым путем.

Для ГВ характерно многообразие форм проявления инфекции. У большинства инфицированных лиц ГВ находятся в латентном состоянии, однако под действием многих внешних и/или внутренних факторов происходит их реактивация.  Наиболее тяжелые последствия наблюдаются при развитии иммунодефицитных состояний. Известно, что непосредственной причиной гибели больных ВИЧ-инфекцией нередко являются заболевания, связанные с реактивацией ЦМВ. Особого внимания заслуживают бессимптомные формы, при которых вирус выделяется из организма и может передаваться как по горизонтали, в том числе половым путем, так и по вертикали – в процессе внутриутробного развития плода. Опасность представляет также отсутствие четких дифференцирующих клинических признаков, нередко наблюдаемое при манифестации инфекций, вызванных ГВ. Приведенные сведения показывают актуальность проведения лабораторной диагностики ГВИ, которая необходима для надежного установления диагноза, определения формы и стадии заболевания, своевременного начала лечения и мониторинга терапии.

Способы диагностики герпесвирусной инфекции

В настоящее время для лабораторной диагностики герпесвирусной инфекции  используют 2 основных метода (2): серологический и молекулярно-биологический. В серологическом методе определяют антитела к ВПГ или ЦМВ путем иммуноферментного анализа (ИФА). В молекулярно-биологическом – выявляют геномную ДНК герпесвирусов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Оба метода имеют как положительные стороны, так и отрицательные. К недостаткам серологического метода относится низкая информативность идентификации антител класса IgG из-за присутствия антител этого класса у большей части населения, имеющих ГВ в латентном состоянии. Антитела класса IgM к ВПГ и ЦМВ могут свидетельствовать о реактивации вирусов или об острой форме инфекции, но часто не выявляются при иммунодефицитных состояниях, а также при незрелом иммунитете у новорожденных. С другой стороны известно, что  ГВ вызывают нарушения иммуногенеза, приводящие к длительной циркуляции противовирусных анти-IgM в отсутствие активной формы заболевания.  ПЦР обладает высокой чувствительностью, однако его повсеместно широкое применение в практическом здравоохранении в отношении герпесвирусов ограничено. К недостаткам ПЦР следует отнести сложности или невозможность обнаружить вирусные ДНК в некоторых материалах от больных с помощью рутинных процедур выделения ДНК и проведения реакции, как предполагают, из-за присутствия ингибиторов реакции в клинических материалах.

Среди методов лабораторной диагностики давно и хорошо известен культуральный метод, который по мнению многих экспертов до сих пор считают «золотым стандартом» за его высокую специфичность и возможность выделения инфекционно активных вирусов.  Классический культуральный метод состоит из нескольких этапов: 1 – посев клеток культуры, чувствительных к данному вирусу; 2 – внесение в культуру клеток образцов клинического материала; 3 – кратковременная (обычно 1 час) совместная инкубация; 4 – отмывка вируссодержащего материала; 5 – продолжение культивирования клеток вплоть до развития цитопатического действия (ЦПД) вируса, которое оценивается путем микроскопирования и идентификации вирусспецифических морфологических изменений в клеточной культуре, приводящих к гибели клеток.

Существенным недостатком метода является длительность развития ЦПД, сроки наступления которого зависят от количества вируса в клиническом образце и варьируют от нескольких дней до нескольких недель. Очевидно, что для практического здравоохранения метод полезен в качестве подтверждающего, но его невозможно использовать для практической диагностики.

Уникальная способность метода выявлять инфекционную активность вирусов в клиническом материале индуцировала разработку  модификаций культурального метода, первая из которых получила название «shell vial метод» и был использован для обнаружения ЦМВ. Метод предполагает использование специальных пробирок с плоским дном, содержащих круглые покровные стекла, на которые высаживают клетки культуры. После внесения клинического материала пробирки подвергают центрифугированию при 700-1000 об/мин в течение 40 мин. с последующей инкубацией при 37⁰С в течение 16-36 часов. Затем клетки на покровных стеклах окрашивают моноклональными антителами (МКА), специфичными в отношении «раннего белка ЦМВ 72000 дальтон». Введение центрифугирования в сочетании с МКА позволило значительно повысить чувствительность культурального метода, не снизив при этом его специфичности. Кроме того, метод позволяет обнаружить вирусные белки на ранних стадиях инфекции,  не дожидаясь развития цитопатического действия и гибели зараженных клеток, что сократило время проведения теста до одного дня.

В лаборатории клеточной инженерии ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН была разработана модификация метода «shell vial», которая получила название «быстрый культуральный метод (БКМ)» (3). Быстрый культуральный метод выявления герпесвирусов ВПГ и ЦМВ включает несколько последовательных этапов.

Для анализа ВПГ используются клетки перевиваемой линии Vero, которые выращивают в культуральных флаконах в среде Игла МЕМ с добавлением 10% ЭТС, 2 мМ глютамина и гентамицина (50 мкг/мл). Клетки снимают с помощью смеси химопсина (10 мг/мл) и версена, высаживают в 24-луночные панели с покровными стеклами в концентрации 60 тыс. клеток/мл и помещают в СО₂-инкубатор с концентрацией СО₂ 5-7%.

Для выявления ЦМВ клетки ФЭЧ выращивают в культуральных флаконах в среде ДМЕМ с 10% ЭТС до образования монослоя, затем снимают с помощью смеси химопсина (10 мг/мл) и версена и высаживают на дно лунок 48-луночных панелей в концентрации 100 тыс. клеток/мл. Слюну, ликвор, слезную жидкость, мочу, эякулят помещают в стерильные контейнеры для исследования мочи и других биоматериалов (типа Vacuette, Австрия). Урогенитальные соскобы помещают в стерильные пробирки (типа Eppendorf, США) с транспортной средой (культуральная среда без сыворотки с утроенной концентрацией антибиотиков– 150 мг/мл для гентамицина).

Кровь забирают в стерильные пробирки для гематологических исследований с ЭДТА-КЗ (типа Vacuette, Австрия). Цельную кровь центрифугируют в течение 10 мин при 1000 об./мин. Затем стерильно отбирают фракцию лейкоцитов, расположенную над эритроцитами. Для проведения БКМ в культуру клеток вносят по 0,2 мл лейкоцитарной фракции. Мочу центрифугируют в тех же условиях. Используют осадок клеток в объеме 0,2 мл. Ликвор, слюну и цельный эякулят разводят в 2 раза средой ИГЛА МЕМ и вносят в объеме 0,2 мл в культуру клеток. Урогенитальные соскобы, помещенные в транспортную среду, тщательно пипетируют и вносят в культуру клеток в объеме 0,2 мл.

Подготовленный для анализа клинический материал в зависимости от того, какой вирус исследуется, вносят в объеме 0,2 мл либо в лунки 24-луночных панелей с покровными стеклами, на поверхности которых выращены клетки Vero (для выявления ВПГ), либо  в лунки 48-луночных панелей без стекол в том же объеме – для выявления ЦМВ.

Панели помещают в  СО₂-инкубатор с 5-7% СО₂ . Инкубация клеток культуры и клинического материала осуществляется  в течение 1 часа при 37⁰С. Затем клетки отмывают, вносят свежую среду  и помещают в  СО₂-инкубатор на 24 часа (панели с клетками Vero) или на 48 часов (панели с клетками ФЭЧ). По окончании срока инкубации лунки панелей с клетками трижды промывают средой без сыворотки или ФСБ. Для выявления ЦМВ в каждую лунку 48-луночных панелей вносят охлажденный метанол (+4⁰С) по 0,5 мл на 30 мин. при -15⁰С-20⁰С, после этого промывают однократно ФСБ, высушивают и проводят иммуноцитохимическую окраску (ИПО).

Для выявления ВПГ из 24-луночных панелей вынимают покровные стекла с клетками, промывают в ФСБ и высушивают при комнатной температуре. Затем стекла помещают в охлажденный ацетон (в стеклянной посуде) на 30 мин при +4⁰С. После фиксации стекла вынимают из ацетона, высушивают при комнатной температуре, монтируют на предметные стекла и проводят реакцию ИФл.

Для выявления ВПГ в клетках Vero на стекла наносят  30 мкл МКА к ВПГ на 1 час при 37⁰С., отмывают ФСБ или дистиллированной водой 3 раза по 5 мин. Затем наносят по 30 мкл антимышиных МКА, меченных ФИТЦ и инкубируют в течение 25 мин при 37⁰С. После инкубации стекла промывают, как описано ранее, и просматривают под люминесцентным микроскопом.

Для выявления ЦМВ в клетках ФЭЧ в лунки 48-луночной панели вносят по 100 мкл МКА к ЦМВ на 1 час при 37⁰С, затем промывают и наносят по 100 мкл антимышиных МКА, меченных пероксидазой хрена на 1 час при 37⁰С. После промывки   в лунки вносят по 100 мкл субстрата, содержащего 0,5 мг/мл ДАБ в 0,05М Tris-HCl (pH 7,2) в присутствии 1 мкл/мл 30% перекиси водорода и инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре в темноте. Затем реакцию останавливают, промывая лунки водой, и клетки просматривают в инвертированном микроскопе.

Анализ и интерпретация результатов

Результаты иммуноцитохимической окраски в обоих вариантах (ИФл и ИПО) регистрируют путем подсчета окрашенных клеток, содержащих белки ВПГ или ЦМВ. Вычисляют долю окрашенных клеток на 200 тыс. клеток популяции. При интерпретации результатов БКМ следует воспользоваться усредненными данными, полученными на основе изучения десятков тысяч пациентов, инфицированных герпесвирусами. Для ЦМВ   определены следующие параметры:

– при обнаружении 1-3 окрашенных клеток на 200 тыс. клеток культуры следует начать лечение при высоком риске заболевания;

– при обнаружении 10 окрашенных клеток на 200 тыс. клеток культуры следует начать лечение при низком риске развития заболевания;

– обнаружение 100  клеток на 200 тыс. клеток культуры коррелирует с проявлением клинических признаков заболевания.

Опыт изучения пациентов с подозрением на ВПГ-инфекцию позволяет считать диагностически значимыми количества инфекционно активного вируса, соответствующие 20% и более окрашенных клеток Vero на 200 тыс клеток. При количестве окрашенных клеток, превышающем 50% клеток культуры, в большинстве случаев наблюдаются клинические признаки герпесвирусных инфекций.

БКМ обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Метод позволяет выявлять герпесвирусы ВПГ и ЦМВ в материалах  из различных органов и тканей как у бессимптомно инфицированных пациентов, так и у больных в острой фазе заболевания. БКМ способен обнаруживать герпесвирусы также в аутопсийном материале, что важно для постмортальной диагностики и определения причины смерти. БКМ позволяет диагностировать ВПГ- и ЦМВ-инфекции уже на ранних  стадиях заболевания, а именно в тот период, когда еще не выявляются специфические антитела. Одним из преимуществ количественного определения инфекционной активности герпесвирусов с помощью БКМ является возможность мониторинга  вирусной нагрузки при интерферонотерапии, а также при терапии другими противовирусными препаратами. БКМ эффективен при оценке противовирусных свойств новых разработок: противогерпетических средств, находящихся на доклинической и клинической фазах испытаний. БКМ также как и ПЦР выявляет прямые маркеры ГВ: ПЦР – ДНК-геном, БКМ ? присутствие инфекционно активных вирусов. Таким образом, два этих метода дополняют друг друга и характеризуют разные параметры герпесвирусов.

Примеры использования быстрого культурального метода

Быстрый культуральный метод (БКМ) используется как один из методов лабораторной диагностики для выявления герпесвирусов (ВПГ и ЦМВ) при обследовании пациентов, относящихся к группам риска по развитию ГВИ. Ниже приведены результаты изучения клинических материалов, полученных  из разных органов и тканей от пациентов, представляющих наиболее типичные группы риска. Специальные разделы посвящены использованию БКМ в химиотерапевтических целях – для анализа противовирусных свойств новых химиопрепаратов и биологически активных веществ.

Выявление ВПГ и ЦМВ у новорожденных детей

На первой неделе жизни обследовано 147 новорожденных детей, находившихся в ГБ №8 г. Москвы: 112 недоношенных маловесных детей с проявлениями ВУИ находились в отделении  реанимации и интенсивной терапии, 35 практически здоровых детей составляли контрольную группу.

От каждого новорожденного ребенка в первые 7 дней жизни исследовали мочу, кровь, слюну и по показаниям – ликвор. Если ГВ определяли хотя бы в одном материале, результаты обследования данного ребенка оценивали как положительные и ребенка считали инфицированным. Результаты обнаружения ВПГ и ЦМВ в обеих группах новорожденных детей приведены в Таблице 1.

Таблица 1.

Частота выявления герпесвирусов у недоношенных новорожденных детей при первичном обследовании в первые дни жизни

Результаты показали, что частота определения ЦМВ БКМ и ПЦР в группе недоношенных детей была приблизительно одинаковой, тогда как в контрольной группе больше положительных образцов было выявлено с помощью ПЦР. Это может свидетельствовать о большей чувствительности ПЦР или об отсутствии выраженной инфекционной активности вируса, обнаруженного в материалах практически здоровых детей.

Таблица 2.

Частота выявления ЦМВ в аутопсиях плодов и умерших детей на цитологических препаратах  и в культуре клеток БКМ

 Таблица 3.Частота выявления ВПГ на разных стадиях герпесвирусной инфекции.

Сравнение эффективности обнаружения ВПГ показало, что этот вирус был выявлен ПЦР с меньшей частотой как в группе недоношенных детей, так и в контрольной группе. Можно предположить, что ПЦР, проведенная в сертифицированной лаборатории  и использованная для определения ВПГ, требует доработки и повышения чувствительности. 

Выявление ЦМВ в биопсийных материалах для выяснения роли ЦМВ-инфекции в детской смертности.

Исследовано 88 аутопсийных образцов от 30 плодов, умерших новорожденных детей и детей, умерших на первом году жизни, у которых при патологоанатомическом исследовании возникло подозрение на врожденную вирусную инфекцию.

Образцы анализировали 2 методами: 1 – обычно используемым иммуноцитохимическим – для обнаружения АГ ЦМВ в отпечатках органов и 2 – быстрым культуральным – для выявления инфекционной активности ЦМВ в аутопсийном материале.  Данные представлены в Таблице 2. Они показали, что БКМ позволяет определять вирусную активность в различных органах и в среднем обнаруживает в 2 раза больше инфицированных образцов, чем цитохимический метод исследования отпечатков органов. Это свидетельствует об эффективности использования БКМ для посмертного подтверждения диагноза ЦМВИ.

БКМ в диагностике генитального герпеса

Эффективность выявления ВПГ изучалась на разных стадиях герпесвирусной инфекции. Обследовано 25 больных рецидивирующим генитальным герпесом в процессе развития рецидива заболевания, каждый пациент  был обследован трижды: на стадиях обострения, эпителизации и ремиссии. Проведено сравнение четырех методов выявления ВПГ в соскобах уретры: 1 – иммуноцитохимического метода выявления антигена (АГ) ВПГ в мазках, 2 – быстрого культурального метода (БКМ), 3 – иммуноферментного метода определения АГ ВПГ (ИФА) и 4 – полимеразной цепной реакции (ПЦР). Результаты представлены в Таблице 3. Они показали, что БКМ обнаруживал ВПГ в инфицированных образцах на всех стадиях заболевания, причем на стадии обострения даже в большем количестве, чем ПЦР. Как было выяснено в специально проведенных опытах, результатом более низкого выявления ВПГ рутинным методом ПЦР, явились присутствующие в образцах ингибиторы ПЦР и недостаточно полное выделение ДНК ВПГ из урогенитальных образцов. Изменение протокола выделения ДНК и удаление ингибиторов реакции позволили повысить выявляемость ДНК ВПГ в стадии обострения до 80%.

БКМ позволил повысить эффективность определения ВПГ в урогенитальных материалах методом ПЦР и показал столь же высокие результаты как и усовершенствованная ПЦР.

Таким образом, внедрение БКМ в практику здравоохранения необходимо для увеличения надежности диагностики герпесвирусных инфекций как социально значимых заболеваний, передающихся половым путем. Это позволит повысить здоровье населения, улучшить качество жизни  инфицированных лиц и увеличить рождаемость здоровых детей.

Литература:
1. Кострова О.М., Львов Н.Д., Алешкин В.А., Баринский И.Ф. “Гамма-глобулины в профилактике и терапии герпесвирусной инфекции”. “Вопросы вирусологии”, 91г, №3.
2. Герпесвирусная инфекция. Эпидемиология, клиника, диагностика, профилактика и лечение. Методические рекомендации, Москва, 2007.
3. Полимеразная цепная реакция в диагностике урогенитальных инфекций.
(Пособие для врачей), Москва, 2000.
4. Быстрый культуральный метод диагностики герпесвирусных инфекций. Методические рекомендации № 02.030-80, Москва, 2008.

Покупаете ли Вы заблаговременно средства для профилактики в аптеке?

Опрос анонимный

• Да, покупаю
• Нет, не покупаю

 Загрузка …

Пройти другие опросы

Читайте также:

• 
  

  

  Вирусные урогенитальные инфекции

• 
  

  

  Как лечить цитомегаловирус

• 
  

  

  Детская вирусная инфекция